Assessment of chilling injury in hypothermic stored boar spermatozoa by multicolor flow cytometry

Hipotermiczne przechowywanie nasienia knura może pozwolić na zachowanie nasienia bez antybiotyków, ale jest ograniczone ze względu na wrażliwość plemników knura na zimno. Postęp w tej dziedzinie wymaga wrażliwych narzędzi do wykrywania przeziębień. W związku z tym oceniono wieloparametrowe panele cytometrii przepływowej, aby ustalić, czy są one użytecznymi narzędziami do identyfikacji subletalnych uszkodzeń funkcji plemników na poziomie pojedynczej komórki, uwzględniając tym samym wysoką wewnętrzną niejednorodność plemników w próbce. Pierwszy panel fluorochromowy składał się z Hoechst 33342 do identyfikacji zdarzeń zawierających DNA, Yo-Pro 1 do wykrywania żywotności, merocyjaniny 540 do opisywania płynności błony oraz PNA-Alexa Fluor 647 do identyfikacji integralności akrosomicznej. Drugi panel fluorochromowy składał się z SiR700-DNA do identyfikacji zdarzeń zawierających DNA, JC-1 do scharakteryzowania mitochondrialnego potencjału przezbłonowego (MMP) oraz  Calbryte  630 do oceny wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia.
Rozszerzone nasienie knura przechowywano w temperaturze 17°C (kontrola) lub 5°C (schłodzone). Wykazano, że schładzanie zwiększyło płynność błony w żywej populacji plemników (z ujemnym wynikiem Yo-Pro 1) po 24 godzinach (p < 0,05). Po 144 godzinie populacja żywych, nienaruszonych akrosomicznie plemników o niskiej płynności błony była podobna dla obu temperatur przechowywania. Ponadto schładzanie zmniejszyło główną populację plemników z wysokim MMP, średnią fluorescencją dla monomeru JC-1 i niskim poziomem wapnia wewnątrzkomórkowego (p < 0,05). Jednak po kapacytacji plemników in vitro populacja ta nie różniła się między dwiema temperaturami przechowywania.
Przykładowa wizualizacja danych obliczeniowych na mapach stochastycznych osadzania sąsiadów z rozkładem t (t-SNE) i ruchomych wykresach radarowych ujawniła podobne subpopulacje zidentyfikowane za pomocą trójwymiarowych skumulowanych wykresów słupkowych. Podsumowując, plemniki, które przeżyły początkowy uraz polegający na wyziębieniu, wytrzymują długotrwałe przechowywanie i reagują w podobny sposób na warunki kapacytacji, jak plemniki przechowywane konwencjonalnie w temperaturze 17 °C. Wielobarwna cytometria przepływowa jest cennym narzędziem do wykrywania zmian funkcji komórek wywołanych wychłodzeniem w subpopulacjach plemników.

Sondowanie nanoelektroporacji i ponowne zamykanie błony komórkowej przez wnikanie jonów Ca2+ i Ba2+.

Głównym efektem biologicznym nanosekundowego pulsującego pola elektrycznego (nsPEF) jest trwała permeabilizacja błony komórkowej, którą często przypisuje się tworzeniu porów o rozmiarach nanometrowych. Takie pory mogą być zbyt małe do wykrycia przez wychwyt barwników fluorescencyjnych. Zbadaliśmy, czy jony Ca 2+ , Cd 2+ , Zn 2+ i Ba 2+  mogą być użyte jako markery nanoporacji. Obrazowanie poklatkowe przeprowadzono w komórkach CHO, BPAE i HEK obciążonych barwnikami Fluo-4,  Calbryte lub Fluo-8. Ca 2+  i Ba 2+  nie zmieniły fluorescencji w nienaruszonych komórkach , natomiast ich wejście po nsPEF zwiększyło fluorescencję w ciągu <1 ms.
Calbryte 520 AM

Calbryte 520 AM

Próg dla jednego impulsu 300 ns wynosił 1,5-2 kV/cm, znacznie niższy niż >7 kV/cm dla tworzenia większych porów, które dopuszczały do ​​wnętrza barwnika YO-PRO-1, TO-PRO-3 lub propidium. komórki. Wejście Ba 2+  spowodowało stopniowy wzrost emisji, która osiągnęła stabilny poziom w ciągu 2 min lub, przy bardziej intensywnym nsPEF, stale rosła przez co najmniej 30 min. Wejście Ca 2+  mogło wywołać uwalnianie wapnia indukowane wapniem (CICR), a następnie usunięcie Ca 2+  z cytozolu, co znacząco wpłynęło na przebieg czasowy, polaryzację, amplitudę i zależność zmiany fluorescencji od dawki. Zarówno Ca 2+ , jak  i Ba 2+  okazały się być czułymi markerami nanoporacji, przy czym Ba 2+  jest bardziej niezawodny w monitorowaniu uszkodzeń membrany i ponownym uszczelnianiu.

Ocena wpływu kalikuliny A na tworzenie ognisk γH2AX/53BP1 i apoptozę w ludzkich limfocytach krwi pępowinowej

Inhibitor defosforylacji,  kalikulina A ( cal  A), hamuje zanikanie wywołanych promieniowaniem ognisk naprawy DNA γH2AX w ludzkich limfocytach Jednak inne badania wykazały brak zmian w kinetyce indukcji i utraty ogniska γH2AX w napromieniowanych komórkach. Chociaż apoptoza może współgrać z kinetyką tworzenia się ognisk, nie obserwowano jej w napromieniowanych komórkach wraz z ogniskami naprawy DNA. Tak więc, aby potwierdzić wiarygodne wyjaśnienia znaczącej zmienności wyników tych badań, oceniliśmy wpływ  cal  A (1 i 10 nM) na ogniska naprawy DNA γH2AX/53BP1 i apoptozę napromieniowanych (1, 5, 10 i 100 cGy) ludzka pępowina  _limfocyty krwi (UCBL) przy użyciu, odpowiednio, automatycznej mikroskopii fluorescencyjnej i testu aneksyny V-FITC/jodku propidyny/barwienia γH2AX.
Nie zaobserwowano wpływu  cal  A na γH2AX i kolokalizowane ogniska γH2AX/53BP1 indukowane niskimi dawkami (≤10 cGy) promieni γ. Co więcej, traktowanie 10 nM  cal  A zmniejszyło liczbę wszystkich typów ognisk naprawy DNA indukowanych przez napromieniowanie 100 cGy. 10 nM  cal  Leczenie indukowało apoptozę już po 2 godzinach leczenia, niezależnie od dostarczonej dawki. Apoptozę wykryto również w UCBL leczonych niższym  stężeniem kali  A, 1 nM, przy dłuższej inkubacji komórek, 20 i 44 godz. Nasze dane sugerują, że apoptoza wywołana przez  cal  A w UCBL może być przyczyną niepowodzenia  cal A w celu utrzymania wywołanych promieniowaniem ognisk γH2AX. Wszystkie markery molekularne DSB użyte w tym badaniu reagowały liniowo na napromienianie małą dawką. Dlatego ich połączenie może stanowić silne narzędzie biodozymetrii do szacowania odpowiedzi na promieniowanie na niskie dawki. Ocena kolokalizowanego γH2AX /53BP1 poprawiła próg wykrywania niskich dawek.

LOKALIZOWANIE STOŻKOWYCH PRZECIĘĆ CYTOZYNY ZA POMOCĄ EKSPERYMENTÓW LASEROWYCH I OBLICZEŃ AB INITIO.

Mechanizm rozpadu wzbudzonej cytozyny S0 → S1 (Cyt) oraz efekt substytucji badano łącząc spektroskopię z chłodzeniem strumieniowym (rezonansowa jonizacja dwóch fotonów ns (R2PI) i pomiary czasu życia ps) z obliczeniami CASPT2//CASSCF dla ośmiu pochodnych. Dla Cyt i pięciu pochodnych podstawionych w N1, C5 i C6, szybka wewnętrzna konwersja zachodzi przy 250 – 1200 cm-1 powyżej pasm 00. Załamanie  w widmach koreluje z obliczonymi barierami w kierunku CI „skrętu C5-C6”, co jednoznacznie ustala mechanizm zaniku przy niskich energiach drgań stanu S1. 
Bariery zwiększają się wraz z podstawnikami, które stabilizują przesunięcia ładunku przy C4, C5 i C6 po wzbudzeniu (1ππ∗). Widma R2PI pochodnych 5,6-trimetylenoCyt (TMCyt) i 1-metylo-TMCyt (1M-TMCyt), rozpadających się wzdłuż współrzędnej N3 poza płaszczyzną, rozciągają się do +3500 i +4500 cm-1 .

NOWE SULFONYLOWE CHROMEN-4-ONY (CHW09) PREFERENCYJNIE ZABIJAJĄ KOMÓRKI RAKA JAMY USTNEJ WYKAZUJĄCE APOPTOZĘ, STRES OKSYDACYJNY I USZKODZENIA DNA.

Kilka funkcjonalizowanych chromonów, kluczowych składników naturalnie występujących utlenionych heterocykli, ma działanie przeciwnowotworowe, ale ich związki sulfonowe są rzadko badane. W tym badaniu zainstalowaliśmy podstawnik sulfonylowy do szkieletu chromen-4-onu i zsyntetyzowaliśmy CHW09, aby ocenić jego działanie przeciwnowotworowe jamy ustnej pod względem żywotności komórek, cyklu komórkowego, apoptozy, stresu oksydacyjnego i uszkodzeń DNA. W teście żywotności komórek CHW09 preferencyjnie zabija dwie komórki raka jamy ustnej (Ca9-22 i  CAL  27), mniej wpływając na normalne komórki jamy ustnej (HGF-1). Chociaż CHW09 nie zmienia znacząco dystrybucji cyklu komórkowego, CHW09 indukuje apoptozę potwierdzoną cytometrią przepływową dla aneksyny V i metodą western blotting dla rozszczepionej polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP) i kaspaz 3/8/9.

Calbryte™ 520 AM

20650 AAT Bioquest 2x50 ug 109 EUR

Calbryte™ 520 AM

20651 AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Calbryte™ 520 AM

20653 AAT Bioquest 1 mg 446 EUR

Calbryte™ 630 AM

20720 AAT Bioquest 2x50 ug 222 EUR

Calbryte™ 630 AM

20721 AAT Bioquest 10x50 ug 446 EUR

Calbryte™ 630 AM

20722 AAT Bioquest 1 mg 784 EUR

Calbryteâ„¢ 520 AM

20650-2x50ug AAT Bioquest 2x50 ug 109 EUR

Calbryteâ„¢ 520 AM

20651-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Calbryteâ„¢ 520 AM

20653-1mg AAT Bioquest 1 mg 446 EUR

Calbryte™-520L AM

20640 AAT Bioquest 10x50 ug 367.2 EUR

Calbryte™-520XL AM

20646 AAT Bioquest 10x50 ug 367.2 EUR

Calbryte™ 520, potassium salt

20656 AAT Bioquest 2x50 ug 222 EUR

Calbryte™ 520, potassium salt

20658 AAT Bioquest 10x50 ug 446 EUR

Calbryte™-520XL azide

20643 AAT Bioquest 1 mg 558 EUR

Screen Questâ„¢ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36317-1Plate AAT Bioquest 1 Plate 222 EUR

Screen Questâ„¢ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36318-10Plates AAT Bioquest 10 Plates 784 EUR

Screen Questâ„¢ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36319-100Plates AAT Bioquest 100 Plates 5572 EUR

Calbryte™ 590, potassium salt

20706 AAT Bioquest 5x50 ug 334 EUR

Calbryte™ 590, potassium salt

20707 AAT Bioquest 1 mg 846 EUR

Calbryte™ 630, potassium salt

20727 AAT Bioquest 5x50 ug 334 EUR

Calbryte™-520L, potassium salt

20642 AAT Bioquest 10X50 ug 334 EUR

Calbryteâ„¢ 590 AM

20700-2x50ug AAT Bioquest 2x50 ug 222 EUR

Calbryteâ„¢ 590 AM

20701-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 446 EUR

Calbryteâ„¢ 590 AM

20702-1mg AAT Bioquest 1 mg 671 EUR

Calbryteâ„¢ 630 AM

20720-2x50ug AAT Bioquest 2x50 ug 222 EUR

Calbryteâ„¢ 630 AM

20721-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 446 EUR

Calbryteâ„¢ 630 AM

20722-1mg AAT Bioquest 1 mg 784 EUR

Calbryte™-520XL, potassium salt

20645 AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36317 AAT Bioquest 1 Plate 222 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36318 AAT Bioquest 10 Plates 784 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36319 AAT Bioquest 100 Plates 5572 EUR

Calbryte™-520XL-Dextran

20648 AAT Bioquest 1 mg 367.2 EUR

Calbryteâ„¢ 520, potassium salt

20656-2x50ug AAT Bioquest 2x50 ug 222 EUR

Calbryteâ„¢ 520, potassium salt

20657-1mg AAT Bioquest 1 mg 713 EUR

Calbryteâ„¢ 520, potassium salt

20658-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 446 EUR

Screen Questâ„¢ Calbryte-590 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36200-1Plate AAT Bioquest 1 Plate 334 EUR

Screen Questâ„¢ Calbryte-590 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36201-10Plates AAT Bioquest 10 Plates 1070 EUR

Screen Questâ„¢ Calbryte-590 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36202-100Plates AAT Bioquest 100 Plates 7822 EUR

Screen Quest™ Calbryte-590 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36200 AAT Bioquest 1 Plate 334 EUR

Screen Quest™ Calbryte-590 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36201 AAT Bioquest 10 Plates 1070 EUR

Screen Quest™ Calbryte-590 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36202 AAT Bioquest 100 Plates 7822 EUR

Calbryteâ„¢-520XL azide

20643-1mg AAT Bioquest 1 mg 558 EUR

Calbryteâ„¢ 590, potassium salt

20706-5x50ug AAT Bioquest 5x50 ug 334 EUR

Calbryteâ„¢ 590, potassium salt

20707-1mg AAT Bioquest 1 mg 846 EUR

Calbryteâ„¢ 630, potassium salt

20727-5x50ug AAT Bioquest 5x50 ug 334 EUR

Calbryteâ„¢-520L, potassium salt

20642-10X50ug AAT Bioquest 10X50 ug 334 EUR

Cal-520®, AM

21131 AAT Bioquest 1 mg 334 EUR

Cal-520®, AM

21130 AAT Bioquest 10x50 ug 222 EUR

Mag-520™ AM

20406 AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Metal Fluorâ„¢ Zn-520, AM

21263-1mg AAT Bioquest 1 mg 222 EUR

Metal Fluor™ Zn-520, AM

21263 AAT Bioquest 1 mg 222 EUR

Calcein AM

1755-1000 Biovision each 444 EUR

Calcein AM

1755-250 Biovision each 392.4 EUR

Calcein AM

1755-50 Biovision each 157.2 EUR

Calcein AM

BMD0064-10mg Abbkine 10 mg 2069 EUR

Calcein AM

BMD0064-1mg Abbkine 1 mg 279 EUR

Calcein,-AM

E37F22002 EnoGene 1-mg 600 EUR

Calcein-AM

GT0291-1MG Glentham Life Sciences 1 mg 409.2 EUR

Calcein-AM

HY-D0041 MedChemExpress 100ug 176.4 EUR

Calcein-AM

GT0291-1 Glentham Life Sciences 1 248.6 EUR

Calcein-AM

06735-81 NACALAI TESQUE 1MG 98 EUR

Cal-520® maleimide

20610 AAT Bioquest 100 ug 446 EUR

Cal-500â„¢ AM

20412-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 222 EUR

Cal-590â„¢ AM

20510-5x50ug AAT Bioquest 5x50 ug 222 EUR

Cal-590â„¢ AM

20511-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Cal-590â„¢ AM

20512-1mg AAT Bioquest 1 mg 558 EUR

Cal-630â„¢ AM

20530-5x50ug AAT Bioquest 5x50 ug 334 EUR

Cal-630â„¢ AM

20531-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 446 EUR

Cal-630â„¢ AM

20532-1mg AAT Bioquest 1 mg 784 EUR

Cal-520Nâ„¢, AM

21146-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 390 EUR

Cal-520FFâ„¢, AM

21142-1mg AAT Bioquest 1 mg 558 EUR

Cal-520FFâ„¢, AM

21143-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 390 EUR

Cal-520® NHS Ester

20609 AAT Bioquest 100 ug 446 EUR

Cal-520®, sodium salt

21135 AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Cal-520®, sodium salt

21136 AAT Bioquest 1 mg 446 EUR

Calcein Redâ„¢ AM

21900-1mg AAT Bioquest 1 mg 222 EUR

Cal-520®, potassium salt

21140 AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Cal-520®, potassium salt

21141 AAT Bioquest 1 mg 446 EUR

Cal-520®-Biotin Conjugate

20605 AAT Bioquest 5x50 ug 334 EUR

Cal-520®-Biocytin Conjugate

20606 AAT Bioquest 5x50 ug 334 EUR

Calcein AM, (20x50ug)

80011-3 Biotium 20ST 290.4 EUR

Calcein AM 10x50ug

354216 Scientific Laboratory Supplies EACH 339.6 EUR

Cal-520®, AM

21130-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 222 EUR

Cal-520®, AM

21131-1mg AAT Bioquest 1 mg 334 EUR

Cal-590™ AM

20510 AAT Bioquest 5x50 ug 222 EUR

Cal-590™ AM

20511 AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Cal-590™ AM

20512 AAT Bioquest 1 mg 558 EUR

Cal-630™ AM

20530 AAT Bioquest 5x50 ug 334 EUR

Cal-630™ AM

20531 AAT Bioquest 10x50 ug 446 EUR

Cal-630™ AM

20532 AAT Bioquest 1 mg 784 EUR

Cal-500™ AM

20412 AAT Bioquest 10x50 ug 222 EUR

Cal-520N™, AM

21146 AAT Bioquest 10x50 ug 390 EUR

Calcein UltraBlueâ„¢ AM

21908-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 222 EUR

Cal-520FF™, AM

21142 AAT Bioquest 1 mg 558 EUR

Cal-520FF™, AM

21143 AAT Bioquest 10x50 ug 390 EUR

Calcein UltraGreenâ„¢ AM

21905-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 222 EUR

ATTO-520

E37F520-1 EnoGene 1mg 176 EUR

Cal Greenâ„¢ 1, AM [Equivalent to Calcium Green-1, AM]

20501-10x50ug AAT Bioquest 10x50 ug 166 EUR

Cal Greenâ„¢ 1, AM [Equivalent to Calcium Green-1, AM]

20502-1mg AAT Bioquest 1 mg 222 EUR

Calcein Red™ AM

21900 AAT Bioquest 1 mg 222 EUR
Te ekspresje sygnalizacji apoptozy są częściowo zmniejszane przez inhibitor apoptozy (Z-VAD-FMK) lub zmiatacz wolnych rodników (N-acetylocysteina). Ponadto CHW09 indukuje stres oksydacyjny potwierdzony cytometrią przepływową dla generacji reaktywnych form tlenu (ROS) i nadtlenku mitochondrialnego (MitoSOX) oraz tłumienia potencjału błony mitochondrialnej (MMP). CHW09 indukuje również uszkodzenie DNA potwierdzone przez cytometrię przepływową pod kątem wzrostu markera dwuniciowego  przerwania  DNA γH2AX i oksydacyjnego markera uszkodzenia DNA 8-okso-2′-deoksyguanozyny (8-oxodG). Dlatego nasz nowo zsyntetyzowany CHW09 indukuje apoptozę, stres oksydacyjny i uszkodzenia DNA, co może prowadzić do preferencyjnego zabijania komórek raka jamy ustnej w porównaniu z normalnymi komórkami jamy ustnej.

Dodaj komentarz