Assessment of chilling injury in hypothermic stored boar spermatozoa by multicolor flow cytometry

Hipotermiczne przechowywanie nasienia knura może pozwolić na zachowanie nasienia bez antybiotyków, ale jest ograniczone ze względu na wrażliwość plemników knura na zimno. Postęp w tej dziedzinie wymaga wrażliwych narzędzi do wykrywania przeziębień. W związku z tym oceniono wieloparametrowe panele cytometrii przepływowej, aby ustalić, czy są one użytecznymi narzędziami do identyfikacji subletalnych uszkodzeń funkcji plemników na poziomie pojedynczej komórki, uwzględniając tym samym wysoką wewnętrzną niejednorodność plemników w próbce. Pierwszy panel fluorochromowy składał się z Hoechst 33342 do identyfikacji zdarzeń zawierających DNA, Yo-Pro 1 do wykrywania żywotności, merocyjaniny 540 do opisywania płynności błony oraz PNA-Alexa Fluor 647 do identyfikacji integralności akrosomicznej. Drugi panel fluorochromowy składał się z SiR700-DNA do identyfikacji zdarzeń zawierających DNA, JC-1 do scharakteryzowania mitochondrialnego potencjału przezbłonowego (MMP) oraz  Calbryte  630 do oceny wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia.
Rozszerzone nasienie knura przechowywano w temperaturze 17°C (kontrola) lub 5°C (schłodzone). Wykazano, że schładzanie zwiększyło płynność błony w żywej populacji plemników (z ujemnym wynikiem Yo-Pro 1) po 24 godzinach (p < 0,05). Po 144 godzinie populacja żywych, nienaruszonych akrosomicznie plemników o niskiej płynności błony była podobna dla obu temperatur przechowywania. Ponadto schładzanie zmniejszyło główną populację plemników z wysokim MMP, średnią fluorescencją dla monomeru JC-1 i niskim poziomem wapnia wewnątrzkomórkowego (p < 0,05). Jednak po kapacytacji plemników in vitro populacja ta nie różniła się między dwiema temperaturami przechowywania.
Przykładowa wizualizacja danych obliczeniowych na mapach stochastycznych osadzania sąsiadów z rozkładem t (t-SNE) i ruchomych wykresach radarowych ujawniła podobne subpopulacje zidentyfikowane za pomocą trójwymiarowych skumulowanych wykresów słupkowych. Podsumowując, plemniki, które przeżyły początkowy uraz polegający na wyziębieniu, wytrzymują długotrwałe przechowywanie i reagują w podobny sposób na warunki kapacytacji, jak plemniki przechowywane konwencjonalnie w temperaturze 17 °C. Wielobarwna cytometria przepływowa jest cennym narzędziem do wykrywania zmian funkcji komórek wywołanych wychłodzeniem w subpopulacjach plemników.

Sondowanie nanoelektroporacji i ponowne zamykanie błony komórkowej przez wnikanie jonów Ca2+ i Ba2+.

Głównym efektem biologicznym nanosekundowego pulsującego pola elektrycznego (nsPEF) jest trwała permeabilizacja błony komórkowej, którą często przypisuje się tworzeniu porów o rozmiarach nanometrowych. Takie pory mogą być zbyt małe do wykrycia przez wychwyt barwników fluorescencyjnych. Zbadaliśmy, czy jony Ca 2+ , Cd 2+ , Zn 2+ i Ba 2+  mogą być użyte jako markery nanoporacji. Obrazowanie poklatkowe przeprowadzono w komórkach CHO, BPAE i HEK obciążonych barwnikami Fluo-4,  Calbryte lub Fluo-8. Ca 2+  i Ba 2+  nie zmieniły fluorescencji w nienaruszonych komórkach , natomiast ich wejście po nsPEF zwiększyło fluorescencję w ciągu <1 ms.
Calbryte 520 AM

Calbryte 520 AM

Próg dla jednego impulsu 300 ns wynosił 1,5-2 kV/cm, znacznie niższy niż >7 kV/cm dla tworzenia większych porów, które dopuszczały do ​​wnętrza barwnika YO-PRO-1, TO-PRO-3 lub propidium. komórki. Wejście Ba 2+  spowodowało stopniowy wzrost emisji, która osiągnęła stabilny poziom w ciągu 2 min lub, przy bardziej intensywnym nsPEF, stale rosła przez co najmniej 30 min. Wejście Ca 2+  mogło wywołać uwalnianie wapnia indukowane wapniem (CICR), a następnie usunięcie Ca 2+  z cytozolu, co znacząco wpłynęło na przebieg czasowy, polaryzację, amplitudę i zależność zmiany fluorescencji od dawki. Zarówno Ca 2+ , jak  i Ba 2+  okazały się być czułymi markerami nanoporacji, przy czym Ba 2+  jest bardziej niezawodny w monitorowaniu uszkodzeń membrany i ponownym uszczelnianiu.

Ocena wpływu kalikuliny A na tworzenie ognisk γH2AX/53BP1 i apoptozę w ludzkich limfocytach krwi pępowinowej

Inhibitor defosforylacji,  kalikulina A ( cal  A), hamuje zanikanie wywołanych promieniowaniem ognisk naprawy DNA γH2AX w ludzkich limfocytach Jednak inne badania wykazały brak zmian w kinetyce indukcji i utraty ogniska γH2AX w napromieniowanych komórkach. Chociaż apoptoza może współgrać z kinetyką tworzenia się ognisk, nie obserwowano jej w napromieniowanych komórkach wraz z ogniskami naprawy DNA. Tak więc, aby potwierdzić wiarygodne wyjaśnienia znaczącej zmienności wyników tych badań, oceniliśmy wpływ  cal  A (1 i 10 nM) na ogniska naprawy DNA γH2AX/53BP1 i apoptozę napromieniowanych (1, 5, 10 i 100 cGy) ludzka pępowina  _limfocyty krwi (UCBL) przy użyciu, odpowiednio, automatycznej mikroskopii fluorescencyjnej i testu aneksyny V-FITC/jodku propidyny/barwienia γH2AX.
Nie zaobserwowano wpływu  cal  A na γH2AX i kolokalizowane ogniska γH2AX/53BP1 indukowane niskimi dawkami (≤10 cGy) promieni γ. Co więcej, traktowanie 10 nM  cal  A zmniejszyło liczbę wszystkich typów ognisk naprawy DNA indukowanych przez napromieniowanie 100 cGy. 10 nM  cal  Leczenie indukowało apoptozę już po 2 godzinach leczenia, niezależnie od dostarczonej dawki. Apoptozę wykryto również w UCBL leczonych niższym  stężeniem kali  A, 1 nM, przy dłuższej inkubacji komórek, 20 i 44 godz. Nasze dane sugerują, że apoptoza wywołana przez  cal  A w UCBL może być przyczyną niepowodzenia  cal A w celu utrzymania wywołanych promieniowaniem ognisk γH2AX. Wszystkie markery molekularne DSB użyte w tym badaniu reagowały liniowo na napromienianie małą dawką. Dlatego ich połączenie może stanowić silne narzędzie biodozymetrii do szacowania odpowiedzi na promieniowanie na niskie dawki. Ocena kolokalizowanego γH2AX /53BP1 poprawiła próg wykrywania niskich dawek.

LOKALIZOWANIE STOŻKOWYCH PRZECIĘĆ CYTOZYNY ZA POMOCĄ EKSPERYMENTÓW LASEROWYCH I OBLICZEŃ AB INITIO.

Mechanizm rozpadu wzbudzonej cytozyny S0 → S1 (Cyt) oraz efekt substytucji badano łącząc spektroskopię z chłodzeniem strumieniowym (rezonansowa jonizacja dwóch fotonów ns (R2PI) i pomiary czasu życia ps) z obliczeniami CASPT2//CASSCF dla ośmiu pochodnych. Dla Cyt i pięciu pochodnych podstawionych w N1, C5 i C6, szybka wewnętrzna konwersja zachodzi przy 250 – 1200 cm-1 powyżej pasm 00. Załamanie  w widmach koreluje z obliczonymi barierami w kierunku CI „skrętu C5-C6”, co jednoznacznie ustala mechanizm zaniku przy niskich energiach drgań stanu S1. 
Bariery zwiększają się wraz z podstawnikami, które stabilizują przesunięcia ładunku przy C4, C5 i C6 po wzbudzeniu (1ππ∗). Widma R2PI pochodnych 5,6-trimetylenoCyt (TMCyt) i 1-metylo-TMCyt (1M-TMCyt), rozpadających się wzdłuż współrzędnej N3 poza płaszczyzną, rozciągają się do +3500 i +4500 cm-1 .

NOWE SULFONYLOWE CHROMEN-4-ONY (CHW09) PREFERENCYJNIE ZABIJAJĄ KOMÓRKI RAKA JAMY USTNEJ WYKAZUJĄCE APOPTOZĘ, STRES OKSYDACYJNY I USZKODZENIA DNA.

Kilka funkcjonalizowanych chromonów, kluczowych składników naturalnie występujących utlenionych heterocykli, ma działanie przeciwnowotworowe, ale ich związki sulfonowe są rzadko badane. W tym badaniu zainstalowaliśmy podstawnik sulfonylowy do szkieletu chromen-4-onu i zsyntetyzowaliśmy CHW09, aby ocenić jego działanie przeciwnowotworowe jamy ustnej pod względem żywotności komórek, cyklu komórkowego, apoptozy, stresu oksydacyjnego i uszkodzeń DNA. W teście żywotności komórek CHW09 preferencyjnie zabija dwie komórki raka jamy ustnej (Ca9-22 i  CAL  27), mniej wpływając na normalne komórki jamy ustnej (HGF-1). Chociaż CHW09 nie zmienia znacząco dystrybucji cyklu komórkowego, CHW09 indukuje apoptozę potwierdzoną cytometrią przepływową dla aneksyny V i metodą western blotting dla rozszczepionej polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP) i kaspaz 3/8/9.

Calbryte™ 520 AM

20650 AAT Bioquest 2x50 ug 132 EUR

Calbryte™ 520 AM

20651 AAT Bioquest 10x50 ug 306 EUR

Calbryte™ 520 AM

20653 AAT Bioquest 1 mg 393 EUR

Calbryte™-520L AM

20640 AAT Bioquest 10x50 ug 306 EUR

Calbryte™-520XL AM

20646 AAT Bioquest 10x50 ug 306 EUR

Calbryte™ 630 AM

20720 AAT Bioquest 2x50 ug 219 EUR

Calbryte™ 630 AM

20721 AAT Bioquest 10x50 ug 393 EUR

Calbryte™ 630 AM

20722 AAT Bioquest 1 mg 654 EUR

Calbryte™ 520, potassium salt

20656 AAT Bioquest 2x50 ug 219 EUR

Calbryte™ 520, potassium salt

20658 AAT Bioquest 10x50 ug 393 EUR

Cal-520®, AM

21130 AAT Bioquest 10x50 ug 219 EUR

Cal-520®, AM

21131 AAT Bioquest 1 mg 306 EUR

Metal Fluor™ Zn-520, AM

21263 AAT Bioquest 1 mg 219 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36317 AAT Bioquest 1 Plate 219 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36318 AAT Bioquest 10 Plates 654 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36319 AAT Bioquest 100 Plates 4356 EUR

Calbryte™-520XL azide

20643 AAT Bioquest 1 mg 480 EUR

Calbryte™-520XL-Dextran

20648 AAT Bioquest 1 mg 306 EUR

cAMP AM

20300 AAT Bioquest 1 mg 50 EUR

NAADP-AM

20997 AAT Bioquest 2X50 ug 306 EUR

NAADP-AM

20998 AAT Bioquest 250 ug 393 EUR

NAADP-AM

21000 AAT Bioquest 1 mg 876 EUR

BCECF, AM

21202 AAT Bioquest 1 mg 176 EUR

AM 103

HY-14163 MedChemExpress 1mg 2254 EUR

AM-0902

HY-108329 MedChemExpress 100mg 1153 EUR

RT-AM

HY-108715A MedChemExpress 1mg 452 EUR

AM-4668

HY-12585 MedChemExpress 5mg 371 EUR

AM-1638

HY-13467 MedChemExpress 5mg 452 EUR

AM-2394

HY-100221 MedChemExpress 10mM/1mL 216 EUR

BAPTA-AM

HY-100545 MedChemExpress 50mg 436 EUR

AM-2099

HY-100727 MedChemExpress 10mM/1mL 361 EUR

BCECF-AM

HY-101883 MedChemExpress 1mg 316 EUR

Calcein-AM

HY-D0041 MedChemExpress 100ug 147 EUR

EGTA-AM

HY-D0973 MedChemExpress 5mg 587 EUR

SBFI-AM

GK8201-1MG Glentham Life Sciences 1 mg 628 EUR

Calcein-AM

GT0291-1MG Glentham Life Sciences 1 mg 341 EUR

AM resin

20-abx095149 Abbexa
  • 314.00 EUR
  • 592.00 EUR
  • 885.00 EUR
  • 100 g
  • 250 g
  • 500 g

AM 281

B6603-10 ApexBio 10 mg 195 EUR

AM 281

B6603-5 ApexBio 5 mg 125 EUR

AM 281

B6603-50 ApexBio 50 mg 635 EUR

AM 404

B6604-100 ApexBio 100 mg 419 EUR

AM 404

B6604-50 ApexBio 50 mg 261 EUR

BAPTA-AM

B4758-10 ApexBio 10 mg 128 EUR

BAPTA-AM

B4758-5.1 ApexBio 10 mM (in 1mL DMSO) 142 EUR

BAPTA-AM

B4758-50 ApexBio 50 mg 325 EUR

BCECF-AM

B5370-1 ApexBio 1 mg 160 EUR

BCECF-AM

B5370-25 ApexBio 25 mg 2111 EUR

BCECF-AM

B5370-5 ApexBio 5 mg 545 EUR

AM 114

A8163-10 ApexBio 10 mg 119 EUR

AM 114

A8163-25 ApexBio 25 mg 189 EUR

AM 114

A8163-5.1 ApexBio 10 mM (in 1mL DMSO) 108 EUR

AM 114

A8163-50 ApexBio 50 mg 282 EUR

AM 114

A8163-S ApexBio Evaluation Sample 81 EUR

AM 1172

B7392-10 ApexBio 10 mg 235 EUR

AM 1172

B7392-100 ApexBio 100 mg 1414 EUR

AM 1172

B7392-5 ApexBio 5 mg 147 EUR

AM 1172

B7392-50 ApexBio 50 mg 830 EUR

AM-679

B2521-1 Biovision 153 EUR

AM-679

B2521-5 Biovision 430 EUR

AM-251

B2718-25 Biovision 25 mg 510 EUR

AM-251

B2718-5 Biovision 5 mg 166 EUR

AM-095

9581-25 Biovision 588 EUR

AM-095

9581-5 Biovision 185 EUR

Calcein AM

1755-1000 Biovision 370 EUR

Calcein AM

1755-250 Biovision 327 EUR

Calcein AM

1755-50 Biovision 131 EUR

BAPTA AM

2242-25 Biovision 262 EUR

BAPTA AM

2242-5 Biovision 109 EUR

ARRY 520 trifluoroacetate

A4458-10 ApexBio 10 mg 328 EUR

ARRY 520 trifluoroacetate

A4458-25 ApexBio 25 mg 659 EUR

ARRY 520 trifluoroacetate

A4458-5 ApexBio 5 mg 206 EUR

Ascomycin(FK 520)

A3191-100 ApexBio 100 mg 139 EUR

Ascomycin(FK 520)

A3191-5.1 ApexBio 10 mM (in 1mL DMSO) 125 EUR

Ascomycin(FK 520)

A3191-50 ApexBio 50 mg 119 EUR

Calbryte™-520L, potassium salt

20642 AAT Bioquest 10X50 ug 306 EUR

Calbryte™-520XL, potassium salt

20645 AAT Bioquest 10x50 ug 306 EUR

Calbryte™ 590, potassium salt

20706 AAT Bioquest 5x50 ug 306 EUR

Calbryte™ 590, potassium salt

20707 AAT Bioquest 1 mg 702 EUR

Calbryte™ 630, potassium salt

20727 AAT Bioquest 5x50 ug 306 EUR

Fluo-2, AM

20494 AAT Bioquest 10x50 ug 176 EUR

Fluo-2, AM

20495 AAT Bioquest 1 mg 219 EUR

Rhod-FF, AM

21077 AAT Bioquest 1 mg 306 EUR

Rhod-FF, AM

21078 AAT Bioquest 10x50 ug 219 EUR

AM-92016 (hydrochloride)

HY-101253 MedChemExpress 10mM/1mL 176 EUR

Fluo-4 AM

HY-101896 MedChemExpress 100ug 546 EUR

Fura-2 AM

HY-101897 MedChemExpress 1mg 408 EUR

Indo-1 AM

HY-101898 MedChemExpress 1mg 366 EUR

Rhod-2 AM

HY-D0989 MedChemExpress 1mg 436 EUR

Fura 2-AM

GK3824-1MG Glentham Life Sciences 1 mg 269 EUR

BAPTA, AM ester

50000 Biotium 25MG 205 EUR

BAPTA, AM ester

50000-1 Biotium 20MG 243 EUR

BCECF, AM ester

51012 Biotium 1MG 137 EUR

Calcein AM, (20x50ug)

80011-3 Biotium 20ST 242 EUR

AM 92016 hydrochloride

B6482-10 ApexBio 10 mg 318 EUR

AM-095 Sodium

B1225-25 Biovision 631 EUR

AM-095 Sodium

B1225-5 Biovision 196 EUR

Poricoic acid AM

TBW00284 ChemNorm 10mg 1295 EUR

AM-92016 Hydrochloride

B2569-25 Biovision 631 EUR

AM-92016 Hydrochloride

B2569-5 Biovision 196 EUR

FURA-4F/AM

9550-50 Biovision 131 EUR
Te ekspresje sygnalizacji apoptozy są częściowo zmniejszane przez inhibitor apoptozy (Z-VAD-FMK) lub zmiatacz wolnych rodników (N-acetylocysteina). Ponadto CHW09 indukuje stres oksydacyjny potwierdzony cytometrią przepływową dla generacji reaktywnych form tlenu (ROS) i nadtlenku mitochondrialnego (MitoSOX) oraz tłumienia potencjału błony mitochondrialnej (MMP). CHW09 indukuje również uszkodzenie DNA potwierdzone przez cytometrię przepływową pod kątem wzrostu markera dwuniciowego  przerwania  DNA γH2AX i oksydacyjnego markera uszkodzenia DNA 8-okso-2′-deoksyguanozyny (8-oxodG). Dlatego nasz nowo zsyntetyzowany CHW09 indukuje apoptozę, stres oksydacyjny i uszkodzenia DNA, co może prowadzić do preferencyjnego zabijania komórek raka jamy ustnej w porównaniu z normalnymi komórkami jamy ustnej.

Dodaj komentarz