Assessment of chilling injury in hypothermic stored boar spermatozoa by multicolor flow cytometry

Hipotermiczne przechowywanie nasienia knura może pozwolić na zachowanie nasienia bez antybiotyków, ale jest ograniczone ze względu na wrażliwość plemników knura na zimno. Postęp w tej dziedzinie wymaga wrażliwych narzędzi do wykrywania przeziębień. W związku z tym oceniono wieloparametrowe panele cytometrii przepływowej, aby ustalić, czy są one użytecznymi narzędziami do identyfikacji subletalnych uszkodzeń funkcji plemników na poziomie pojedynczej komórki, uwzględniając tym samym wysoką wewnętrzną niejednorodność plemników w próbce. Pierwszy panel fluorochromowy składał się z Hoechst 33342 do identyfikacji zdarzeń zawierających DNA, Yo-Pro 1 do wykrywania żywotności, merocyjaniny 540 do opisywania płynności błony oraz PNA-Alexa Fluor 647 do identyfikacji integralności akrosomicznej. Drugi panel fluorochromowy składał się z SiR700-DNA do identyfikacji zdarzeń zawierających DNA, JC-1 do scharakteryzowania mitochondrialnego potencjału przezbłonowego (MMP) oraz  Calbryte  630 do oceny wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia.
Rozszerzone nasienie knura przechowywano w temperaturze 17°C (kontrola) lub 5°C (schłodzone). Wykazano, że schładzanie zwiększyło płynność błony w żywej populacji plemników (z ujemnym wynikiem Yo-Pro 1) po 24 godzinach (p < 0,05). Po 144 godzinie populacja żywych, nienaruszonych akrosomicznie plemników o niskiej płynności błony była podobna dla obu temperatur przechowywania. Ponadto schładzanie zmniejszyło główną populację plemników z wysokim MMP, średnią fluorescencją dla monomeru JC-1 i niskim poziomem wapnia wewnątrzkomórkowego (p < 0,05). Jednak po kapacytacji plemników in vitro populacja ta nie różniła się między dwiema temperaturami przechowywania.
Przykładowa wizualizacja danych obliczeniowych na mapach stochastycznych osadzania sąsiadów z rozkładem t (t-SNE) i ruchomych wykresach radarowych ujawniła podobne subpopulacje zidentyfikowane za pomocą trójwymiarowych skumulowanych wykresów słupkowych. Podsumowując, plemniki, które przeżyły początkowy uraz polegający na wyziębieniu, wytrzymują długotrwałe przechowywanie i reagują w podobny sposób na warunki kapacytacji, jak plemniki przechowywane konwencjonalnie w temperaturze 17 °C. Wielobarwna cytometria przepływowa jest cennym narzędziem do wykrywania zmian funkcji komórek wywołanych wychłodzeniem w subpopulacjach plemników.

Sondowanie nanoelektroporacji i ponowne zamykanie błony komórkowej przez wnikanie jonów Ca2+ i Ba2+.

Głównym efektem biologicznym nanosekundowego pulsującego pola elektrycznego (nsPEF) jest trwała permeabilizacja błony komórkowej, którą często przypisuje się tworzeniu porów o rozmiarach nanometrowych. Takie pory mogą być zbyt małe do wykrycia przez wychwyt barwników fluorescencyjnych. Zbadaliśmy, czy jony Ca 2+ , Cd 2+ , Zn 2+ i Ba 2+  mogą być użyte jako markery nanoporacji. Obrazowanie poklatkowe przeprowadzono w komórkach CHO, BPAE i HEK obciążonych barwnikami Fluo-4,  Calbryte lub Fluo-8. Ca 2+  i Ba 2+  nie zmieniły fluorescencji w nienaruszonych komórkach , natomiast ich wejście po nsPEF zwiększyło fluorescencję w ciągu <1 ms.
Calbryte 520 AM

Calbryte 520 AM

Próg dla jednego impulsu 300 ns wynosił 1,5-2 kV/cm, znacznie niższy niż >7 kV/cm dla tworzenia większych porów, które dopuszczały do ​​wnętrza barwnika YO-PRO-1, TO-PRO-3 lub propidium. komórki. Wejście Ba 2+  spowodowało stopniowy wzrost emisji, która osiągnęła stabilny poziom w ciągu 2 min lub, przy bardziej intensywnym nsPEF, stale rosła przez co najmniej 30 min. Wejście Ca 2+  mogło wywołać uwalnianie wapnia indukowane wapniem (CICR), a następnie usunięcie Ca 2+  z cytozolu, co znacząco wpłynęło na przebieg czasowy, polaryzację, amplitudę i zależność zmiany fluorescencji od dawki. Zarówno Ca 2+ , jak  i Ba 2+  okazały się być czułymi markerami nanoporacji, przy czym Ba 2+  jest bardziej niezawodny w monitorowaniu uszkodzeń membrany i ponownym uszczelnianiu.

Ocena wpływu kalikuliny A na tworzenie ognisk γH2AX/53BP1 i apoptozę w ludzkich limfocytach krwi pępowinowej

Inhibitor defosforylacji,  kalikulina A ( cal  A), hamuje zanikanie wywołanych promieniowaniem ognisk naprawy DNA γH2AX w ludzkich limfocytach Jednak inne badania wykazały brak zmian w kinetyce indukcji i utraty ogniska γH2AX w napromieniowanych komórkach. Chociaż apoptoza może współgrać z kinetyką tworzenia się ognisk, nie obserwowano jej w napromieniowanych komórkach wraz z ogniskami naprawy DNA. Tak więc, aby potwierdzić wiarygodne wyjaśnienia znaczącej zmienności wyników tych badań, oceniliśmy wpływ  cal  A (1 i 10 nM) na ogniska naprawy DNA γH2AX/53BP1 i apoptozę napromieniowanych (1, 5, 10 i 100 cGy) ludzka pępowina  _limfocyty krwi (UCBL) przy użyciu, odpowiednio, automatycznej mikroskopii fluorescencyjnej i testu aneksyny V-FITC/jodku propidyny/barwienia γH2AX.
Nie zaobserwowano wpływu  cal  A na γH2AX i kolokalizowane ogniska γH2AX/53BP1 indukowane niskimi dawkami (≤10 cGy) promieni γ. Co więcej, traktowanie 10 nM  cal  A zmniejszyło liczbę wszystkich typów ognisk naprawy DNA indukowanych przez napromieniowanie 100 cGy. 10 nM  cal  Leczenie indukowało apoptozę już po 2 godzinach leczenia, niezależnie od dostarczonej dawki. Apoptozę wykryto również w UCBL leczonych niższym  stężeniem kali  A, 1 nM, przy dłuższej inkubacji komórek, 20 i 44 godz. Nasze dane sugerują, że apoptoza wywołana przez  cal  A w UCBL może być przyczyną niepowodzenia  cal A w celu utrzymania wywołanych promieniowaniem ognisk γH2AX. Wszystkie markery molekularne DSB użyte w tym badaniu reagowały liniowo na napromienianie małą dawką. Dlatego ich połączenie może stanowić silne narzędzie biodozymetrii do szacowania odpowiedzi na promieniowanie na niskie dawki. Ocena kolokalizowanego γH2AX /53BP1 poprawiła próg wykrywania niskich dawek.

LOKALIZOWANIE STOŻKOWYCH PRZECIĘĆ CYTOZYNY ZA POMOCĄ EKSPERYMENTÓW LASEROWYCH I OBLICZEŃ AB INITIO.

Mechanizm rozpadu wzbudzonej cytozyny S0 → S1 (Cyt) oraz efekt substytucji badano łącząc spektroskopię z chłodzeniem strumieniowym (rezonansowa jonizacja dwóch fotonów ns (R2PI) i pomiary czasu życia ps) z obliczeniami CASPT2//CASSCF dla ośmiu pochodnych. Dla Cyt i pięciu pochodnych podstawionych w N1, C5 i C6, szybka wewnętrzna konwersja zachodzi przy 250 – 1200 cm-1 powyżej pasm 00. Załamanie  w widmach koreluje z obliczonymi barierami w kierunku CI „skrętu C5-C6”, co jednoznacznie ustala mechanizm zaniku przy niskich energiach drgań stanu S1. 
Bariery zwiększają się wraz z podstawnikami, które stabilizują przesunięcia ładunku przy C4, C5 i C6 po wzbudzeniu (1ππ∗). Widma R2PI pochodnych 5,6-trimetylenoCyt (TMCyt) i 1-metylo-TMCyt (1M-TMCyt), rozpadających się wzdłuż współrzędnej N3 poza płaszczyzną, rozciągają się do +3500 i +4500 cm-1 .

NOWE SULFONYLOWE CHROMEN-4-ONY (CHW09) PREFERENCYJNIE ZABIJAJĄ KOMÓRKI RAKA JAMY USTNEJ WYKAZUJĄCE APOPTOZĘ, STRES OKSYDACYJNY I USZKODZENIA DNA.

Kilka funkcjonalizowanych chromonów, kluczowych składników naturalnie występujących utlenionych heterocykli, ma działanie przeciwnowotworowe, ale ich związki sulfonowe są rzadko badane. W tym badaniu zainstalowaliśmy podstawnik sulfonylowy do szkieletu chromen-4-onu i zsyntetyzowaliśmy CHW09, aby ocenić jego działanie przeciwnowotworowe jamy ustnej pod względem żywotności komórek, cyklu komórkowego, apoptozy, stresu oksydacyjnego i uszkodzeń DNA. W teście żywotności komórek CHW09 preferencyjnie zabija dwie komórki raka jamy ustnej (Ca9-22 i  CAL  27), mniej wpływając na normalne komórki jamy ustnej (HGF-1). Chociaż CHW09 nie zmienia znacząco dystrybucji cyklu komórkowego, CHW09 indukuje apoptozę potwierdzoną cytometrią przepływową dla aneksyny V i metodą western blotting dla rozszczepionej polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP) i kaspaz 3/8/9.

Calbryte™ 520 AM

20650 AAT Bioquest 2x50 ug 158.4 EUR

Calbryte™ 520 AM

20651 AAT Bioquest 10x50 ug 367.2 EUR

Calbryte™ 520 AM

20653 AAT Bioquest 1 mg 471.6 EUR

Calbryte™-520L AM

20640 AAT Bioquest 10x50 ug 367.2 EUR

Calbryte™-520XL AM

20646 AAT Bioquest 10x50 ug 367.2 EUR

Calbryte™ 630 AM

20720 AAT Bioquest 2x50 ug 262.8 EUR

Calbryte™ 630 AM

20721 AAT Bioquest 10x50 ug 471.6 EUR

Calbryte™ 630 AM

20722 AAT Bioquest 1 mg 784.8 EUR

Calbryte™ 520, potassium salt

20656 AAT Bioquest 2x50 ug 262.8 EUR

Calbryte™ 520, potassium salt

20658 AAT Bioquest 10x50 ug 471.6 EUR

Cal-520®, AM

21130 AAT Bioquest 10x50 ug 262.8 EUR

Cal-520®, AM

21131 AAT Bioquest 1 mg 367.2 EUR

Mag-520™ AM

20406 AAT Bioquest 10x50 ug 334 EUR

Metal Fluor™ Zn-520, AM

21263 AAT Bioquest 1 mg 262.8 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36317 AAT Bioquest 1 Plate 262.8 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36318 AAT Bioquest 10 Plates 784.8 EUR

Screen Quest™ Calbryte-520 Probenecid-Free and Wash-Free Calcium Assay Kit

36319 AAT Bioquest 100 Plates 5227.2 EUR

Calbryte™-520XL azide

20643 AAT Bioquest 1 mg 576 EUR

Calbryte™-520XL-Dextran

20648 AAT Bioquest 1 mg 367.2 EUR

NAADP-AM

21000 AAT Bioquest 1 mg 1051.2 EUR

BCECF, AM

21202 AAT Bioquest 1 mg 211.2 EUR

cAMP AM

20300 AAT Bioquest 1 mg 60 EUR

NAADP-AM

20997 AAT Bioquest 2X50 ug 367.2 EUR

NAADP-AM

20998 AAT Bioquest 250 ug 471.6 EUR

AM resin

20-abx095149 Abbexa
  • 376.80 EUR
  • 710.40 EUR
  • 1062.00 EUR
  • 100 g
  • 250 g
  • 500 g

AM 114

A8163-10 ApexBio 10 mg 142.8 EUR

AM 114

A8163-25 ApexBio 25 mg 226.8 EUR

AM 114

A8163-5.1 ApexBio 10 mM (in 1mL DMSO) 129.6 EUR

AM 114

A8163-50 ApexBio 50 mg 338.4 EUR

AM 114

A8163-S ApexBio Evaluation Sample 97.2 EUR

AM-251

B2718-25 Biovision 25 mg 612 EUR

AM-251

B2718-5 Biovision 5 mg 199.2 EUR

BAPTA-AM

B4758-10 ApexBio 10 mg 153.6 EUR

BAPTA-AM

B4758-5.1 ApexBio 10 mM (in 1mL DMSO) 170.4 EUR

BAPTA-AM

B4758-50 ApexBio 50 mg 390 EUR

BCECF-AM

B5370-1 ApexBio 1 mg 192 EUR

BCECF-AM

B5370-25 ApexBio 25 mg 2533.2 EUR

BCECF-AM

B5370-5 ApexBio 5 mg 654 EUR

AM 281

B6603-10 ApexBio 10 mg 234 EUR

AM 281

B6603-5 ApexBio 5 mg 150 EUR

AM 281

B6603-50 ApexBio 50 mg 762 EUR

AM 404

B6604-100 ApexBio 100 mg 502.8 EUR

AM 404

B6604-50 ApexBio 50 mg 313.2 EUR

AM 1172

B7392-10 ApexBio 10 mg 282 EUR

AM 1172

B7392-100 ApexBio 100 mg 1696.8 EUR

AM 1172

B7392-5 ApexBio 5 mg 176.4 EUR

AM 1172

B7392-50 ApexBio 50 mg 996 EUR

SBFI-AM

GK8201-1MG Glentham Life Sciences 1 mg 753.6 EUR

Calcein-AM

HY-D0041 MedChemExpress 100ug 176.4 EUR

EGTA-AM

HY-D0973 MedChemExpress 5mg 704.4 EUR

BCECF-AM

HY-101883 MedChemExpress 1mg 379.2 EUR

AM-0902

HY-108329 MedChemExpress 100mg 1383.6 EUR

RT-AM

HY-108715A MedChemExpress 1mg 542.4 EUR

AM-4668

HY-12585 MedChemExpress 5mg 445.2 EUR

AM-1638

HY-13467 MedChemExpress 5mg 542.4 EUR

AM 103

HY-14163 MedChemExpress 1mg 2704.8 EUR

Calcein-AM

GT0291-1MG Glentham Life Sciences 1 mg 409.2 EUR

AM-2394

HY-100221 MedChemExpress 10mM/1mL 259.2 EUR

BAPTA-AM

HY-100545 MedChemExpress 50mg 523.2 EUR

AM-2099

HY-100727 MedChemExpress 10mM/1mL 433.2 EUR

AM-679

B2521-1 Biovision each 183.6 EUR

AM-679

B2521-5 Biovision each 516 EUR

AM-095

9581-25 Biovision each 705.6 EUR

AM-095

9581-5 Biovision each 222 EUR

Calcein AM

1755-1000 Biovision each 444 EUR

Calcein AM

1755-250 Biovision each 392.4 EUR

Calcein AM

1755-50 Biovision each 157.2 EUR

BAPTA AM

2242-25 Biovision each 314.4 EUR

BAPTA AM

2242-5 Biovision each 130.8 EUR

Calbryte™-520L, potassium salt

20642 AAT Bioquest 10X50 ug 367.2 EUR

Calbryte™-520XL, potassium salt

20645 AAT Bioquest 10x50 ug 367.2 EUR

Calbryte™ 590, potassium salt

20706 AAT Bioquest 5x50 ug 367.2 EUR

Calbryte™ 590, potassium salt

20707 AAT Bioquest 1 mg 842.4 EUR

Calbryte™ 630, potassium salt

20727 AAT Bioquest 5x50 ug 367.2 EUR

Ascomycin(FK 520)

A3191-100 ApexBio 100 mg 166.8 EUR

Ascomycin(FK 520)

A3191-5.1 ApexBio 10 mM (in 1mL DMSO) 150 EUR

Ascomycin(FK 520)

A3191-50 ApexBio 50 mg 142.8 EUR

ARRY 520 trifluoroacetate

A4458-10 ApexBio 10 mg 393.6 EUR

ARRY 520 trifluoroacetate

A4458-25 ApexBio 25 mg 790.8 EUR

ARRY 520 trifluoroacetate

A4458-5 ApexBio 5 mg 247.2 EUR

BAPTA, AM ester

50000-1 Biotium 20MG 291.6 EUR

BCECF, AM ester

51012 Biotium 1MG 164.4 EUR

Rhod-5N, AM

21070 AAT Bioquest 1 mg 315.6 EUR

Rhod-FF, AM

21077 AAT Bioquest 1 mg 367.2 EUR

Rhod-FF, AM

21078 AAT Bioquest 10x50 ug 262.8 EUR

Fluo-2, AM

20494 AAT Bioquest 10x50 ug 211.2 EUR

Fluo-2, AM

20495 AAT Bioquest 1 mg 262.8 EUR

Calcein AM, (20x50ug)

80011-3 Biotium 20ST 290.4 EUR

AM 92016 hydrochloride

B6482-10 ApexBio 10 mg 381.6 EUR

Fura 2-AM

GK3824-1MG Glentham Life Sciences 1 mg 322.8 EUR

Rhod-2 AM

HY-D0989 MedChemExpress 1mg 523.2 EUR

Fluo-4 AM

HY-101896 MedChemExpress 100ug 655.2 EUR

Fura-2 AM

HY-101897 MedChemExpress 1mg 489.6 EUR

Indo-1 AM

HY-101898 MedChemExpress 1mg 439.2 EUR

AM-92016 (hydrochloride)

HY-101253 MedChemExpress 10mM/1mL 211.2 EUR

Poricoic acid AM

TBW00284 ChemNorm 10mg 1554 EUR

Calcein AM 10x50ug

354216 Scientific Laboratory Supplies EACH 304.38 EUR

EDTA, AM ester

19010 AAT Bioquest 10x50 ug 109 EUR

EDTA, AM ester

19011 AAT Bioquest 10 mg 166 EUR

AM-92016 Hydrochloride

B2569-25 Biovision each 757.2 EUR
Te ekspresje sygnalizacji apoptozy są częściowo zmniejszane przez inhibitor apoptozy (Z-VAD-FMK) lub zmiatacz wolnych rodników (N-acetylocysteina). Ponadto CHW09 indukuje stres oksydacyjny potwierdzony cytometrią przepływową dla generacji reaktywnych form tlenu (ROS) i nadtlenku mitochondrialnego (MitoSOX) oraz tłumienia potencjału błony mitochondrialnej (MMP). CHW09 indukuje również uszkodzenie DNA potwierdzone przez cytometrię przepływową pod kątem wzrostu markera dwuniciowego  przerwania  DNA γH2AX i oksydacyjnego markera uszkodzenia DNA 8-okso-2′-deoksyguanozyny (8-oxodG). Dlatego nasz nowo zsyntetyzowany CHW09 indukuje apoptozę, stres oksydacyjny i uszkodzenia DNA, co może prowadzić do preferencyjnego zabijania komórek raka jamy ustnej w porównaniu z normalnymi komórkami jamy ustnej.

Dodaj komentarz