Transfekcja komórek T in situ przez nanocząstki lipidowe sprzężone z przeciwciałem przeciwko CD3 prowadzi do aktywacji, migracji i zmiany fenotypowej komórek T

Programowanie ex vivo komórek T może być skuteczne, ale jest złożone i kosztowne; dlatego ważne jest opracowanie metod transfekcji komórek T in situ. Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy nanocząstki lipidowe skierowane przeciwko CD3 (aCD3-LNP), aby dostarczać ciasno upakowane mRNA genu reporterowego specyficznie do komórek T. In vitro ukierunkowane LNP skutecznie dostarczały  mRNA mCherry  do limfocytów T Jurkat, a aktywacja i eliminacja limfocytów T była związana z powlekaniem  przeciwciałem aCD3  na powierzchni LNP. aCD3-LNP, ale nie nieukierunkowane LNP, akumulowały się w śledzionie po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym, z  sygnałami mCherry  i Fluc widocznymi w ciągu 30 minut po wstrzyknięciu.W 24 h po wstrzyknięciu aCD3-LNP, 2-4% wszystkich limfocytów T śledziony i 2-7% wszystkich krążących limfocytów T eksprymowało  mCherry , a to zależało od gęstości powłoki aCD3.
Ukierunkowaniu i transfekcji towarzyszyła ogólnoustrojowa aktywacja limfocytów T CD25 + , OX40 + i CD69 +  z przejściową utratą liganda CD3e oraz zubożeniem podzbiorów śledziony i krążących. Migracja śledziony CD8a + Limfocyty T z miazgi białej do miazgi czerwonej i różnicowanie od fenotypów naiwnych do fenotypów pamięciowych i efektorowych, następowało po dostarczeniu aCD3-LNP. Dodatkowo wstrzyknięcie aCD3-LNP stymulowało wydzielanie do osocza chemokin pochodzenia szpikowego i cytokin T-pomocniczych. Na koniec podaliśmy aCD3-LNP myszom z nowotworem i stwierdziliśmy, że transfekowane limfocyty T zlokalizowane w guzach i węzłach chłonnych drenujących nowotwór po leczeniu immunoterapią. Podsumowując, pokazujemy, że transfekcja ukierunkowana na CD3 jest możliwa, ale wiąże się ze złożonymi konsekwencjami immunologicznymi, które muszą być dalej badane pod kątem potencjalnych zastosowań terapeutycznych.

Wpływ modyfikacji molekularnej na skuteczność inwazji rekombinowanych wektorów bakulowirusowych na komórki ssaków i jego immunogenność u myszy

System wyświetlania bakulowirusa (BDS), doskonała technologia wyświetlania powierzchni eukariotycznych, która oferuje zalety bezpieczeństwa, wydajności i oszczędności, jest szeroko stosowana w biomedycynie. Wcześniejsze badanie z użyciem rBacmid-Δgp64-ires-gp64 eksprymowanego w małej liczbie kopii  genu gp64  osiągnęło wysoką wydajność ekspresji i koekspozycji trzech białek fluorescencyjnych (GFP, YFP i  mCherry ).
mCherry Antibody 100 µg

mCherry Antibody 100 µg

  1. Jednak niska ekspresja GP64 w rekombinowanych bakulowirusach zmniejsza również wydajność transdukcji rekombinowanego bakulowirusa do komórek ssaków. Ponadto promotor bakulowirusa nie wykazuje aktywności ekspresyjnej w komórkach ssaków, a zatem nie może spełniać wymagań aplikacyjnych wektorów bakulowirusowych dla BDS .
  2. W oparciu o wcześniejsze badania, w ramach tego badania najpierw określono aktywność ekspresyjną promotorów w komórkach owadów  Spodoptera frugiperda  9 i komórkach ssaków, a także pomyślnie przebadano bardzo wczesny promotor  pie1  , aby pośredniczyć w koekspresji wielu genów.
  3. Po drugie, wykorzystując efekt prezentacji otoczki białek INVASIN i VSVG, wydajność transdukcji rekombinowanych cząstek bakulowirusa do komórek nie-gospodarza została znacznie poprawiona.
  4. Ostatecznie, w oparciu o powyższe ulepszenie, skonstruowano zrekombinowany wektor bakulowirusowy prezentujący cztery białka antygenowe z wysoką wydajnością. W porównaniu z tradycyjnymi BDS, system rBacmid-Δgp64 wykazywał zwiększoną wydajność prezentacji białka docelowego około 3-krotnie i indukował około 4-krotny wzrost miana  przeciwciał surowicy przeciwko  antygenom docelowym u myszy Bal B/c.
  5. W ramach tego badania systematycznie badano zastosowanie nowej technologii współwyświetlania wielu genów w badaniach nad wieloma szczepionkami, a wyniki stanowią podstawę do opracowania nowatorskich technologii BDS.

Zaburzenie funkcji kinetochoru za pomocą białka wiążącego GFP w drożdżach rozszczepiających

Wykorzystanie mutacji genetycznych do badania funkcji białek in vivo to centralny paradygmat współczesnej biologii. Jednodomenowe  przeciwciała wielbłądowatych  wytworzone przeciwko GFP zostały zaprojektowane jako nanociała lub białka wiążące GFP (GBP), które mogą wiązać GFP, a także niektóre warianty GFP z wysokim powinowactwem i selektywnością. W tym badaniu wykorzystaliśmy białko fuzyjne GBP-mCherry jako  narzędzie do zakłócania naturalnych funkcji kilku białek kinetochorowych w drożdżach rozszczepialnych Schizosaccharomyces pombe.
Odkryliśmy, że komórki jednocześnie eksprymujące GBP – mCherry  i znakowane GFP białko Cnp1 wewnętrznego kinetochoru są wrażliwe na wysoką temperaturę i mikrotubulowy lek, tiabendazol (TBZ). Ponadto, GBP-mCherry ukierunkowany na kinetochor przez  kilka głównych białek kinetochorowych ze znacznikami GFP powoduje defekty w wiernej segregacji chromosomów. W związku z tym to ustawienie narusza funkcje kinetochorów i powoduje, że komórki zachowują się jak mutanty warunkowe.
Nasze badanie podkreśla potencjał wykorzystania GBP jako ogólnego narzędzia do zakłócania funkcji niektórych białek znakowanych GFP in vivo w celu zrozumienia ich funkcjonalnego znaczenia dla niektórych procesów fizjologicznych, nie tylko u drożdży, ale także potencjalnie w innych układach modelowych.

NIEDOCELOWA EKSPRESJA WIRUSÓW ZALEŻNYCH OD CRE I ZWIĄZANYCH Z ADENOWIRUSAMI U MYSZY TYPU DZIKIEGO C57BL/6J

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są powszechnie używanym narzędziem w neuronauce do skutecznego znakowania, śledzenia i/lub manipulowania populacjami neuronów. Wysoce specyficzne ukierunkowanie można osiągnąć poprzez AAV zależne od rekombinazy w połączeniu z transgenicznymi liniami gryzoni, które wyrażają rekombinazę Cre w określonych typach komórek. Wizualizację ekspresji wirusa zazwyczaj uzyskuje się za pomocą fluorescencyjnych białek reporterowych (np. GFP lub  mCherry ) upakowanych w genomie AAV. Chociaż nieamplifikowana fluorescencja jest zwykle wystarczająca do zaobserwowania ekspresji wirusa, immunohistochemiczna amplifikacja reportera fluorescencyjnego jest rutynowo stosowana w celu poprawy wizualizacji wirusa. W niniejszym badaniu AAV zależne od Cre wstrzyknięto do kory nowej myszy C57BL/6J typu dzikiego.
Chociaż obserwowaliśmy słabą, ale spójną nieamplifikowaną ekspresję podwójnej odwróconej otwartej ramki odczytu (DIO) poza docelowym celem u myszy C57BL/6J,   amplifikacja  przeciwciała reportera GFP lub mCherry  ujawniła zauważalną niezależną od Cre ekspresję wirusa. Niedocelowa ekspresja konstruktów DIO u myszy C57BL/6J typu dzikiego występowała niezależnie od dostawcy, serotypu AAV lub promotora. Oceniliśmy również, czy ekspresja niezależna od Cre ma działanie funkcjonalne poprzez receptory projektowane aktywowane wyłącznie przez leki projektowane (DREADD).

SH-PEG-OH,100
33-HE003002-100 Biochempeg
  • 592.80 EUR
  • 1658.40 EUR
  • 1g
  • 5g

Random Hexamers 100 µg
26-4000-03 Gene Link 100 ug 150 EUR

mCherry Antibody
5993-100 Biovision each 483.6 EUR

Anti-PON1 Clone KRJ1 (100 µg)
0801012 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-PON1 Clone KRJ2 (100 µg)
0801014 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-PON1 Clone KRJ1 (100 µg)
801012 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-PON1 Clone KRJ2 (100 µg)
801014 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-CD19-Anti-CD3 Bispecific Antibody (100 µg)
100441-2 BPS Bioscience 100 µg 535 EUR

mCherry Fluorescent Protein
4993-100 Biovision each 489.6 EUR

mCherry Quantification Kit
K971-100 Biovision each 477.6 EUR

Anti-Zika NS1 Clone 1D12 (100 µg)
0801025 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-Zika Envelope Clone 4C7 (100 µg)
0801026 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-Zika NS1 Clone 1D12 (100 µg)
801025 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

mCherry antibody
70R-12458 Fitzgerald 100 ug 632.4 EUR

mCherry Antibody
20-abx159607 Abbexa
  • 326.40 EUR
  • 276.00 EUR
  • 100 ug
  • 50 ug

mCherry Antibody
abx332840-100ul Abbexa 100 ul 510 EUR

mCherry Antibody
5993-30T Biovision each 175.2 EUR

mCherry mAntibody (Clone 1)
5411-100 Biovision each 464.4 EUR

mCherry
MO22192 Neuromics 100 ul 522 EUR

mCherry-Tag Antibody
1-CSB-PA000343 Cusabio
  • 266.40 EUR
  • 234.00 EUR
  • 100ug
  • 50ug

mCherry-tag Antibody
20-abx134448 Abbexa
  • 427.20 EUR
  • 644.40 EUR
  • 260.40 EUR
  • 100 ul
  • 200 ul
  • 30 ul

mCherry-tag Antibody
20-abx134449 Abbexa
  • 427.20 EUR
  • 644.40 EUR
  • 260.40 EUR
  • 100 ul
  • 200 ul
  • 30 ul

mCherry-tag Antibody
20-abx134450 Abbexa
  • 427.20 EUR
  • 644.40 EUR
  • 260.40 EUR
  • 100 ul
  • 200 ul
  • 30 ul

mCherry tag Antibody
abx019132-100ug Abbexa 100 ug 427.2 EUR

mCherry Monoclonal Antibody
ABM40125-003ml Abbkine 0.03ml 189.6 EUR

mCherry Monoclonal Antibody
ABM40125-01ml Abbkine 0.1ml 346.8 EUR

mCherry Monoclonal Antibody
ABM40125-02ml Abbkine 0.2ml 496.8 EUR

mCherry-Tag Antibody
20-abx330249 Abbexa
  • 376.80 EUR
  • 292.80 EUR
  • 100 ug
  • 50 ug

mCherry-Tag Antibody
20-abx330282 Abbexa
  • 376.80 EUR
  • 292.80 EUR
  • 100 ug
  • 50 ug

mCherry-Tag Antibody
20-abx242885 Abbexa
  • 393.60 EUR
  • 326.40 EUR
  • 100 ug
  • 50 ug

Anti-mCherry antibody
STJ120297 St John's Laboratory 100 µl 631.2 EUR

Anti-mCherry antibody
STJ140000 St John's Laboratory 300 µg 324 EUR

Anti-mCherry antibody
STJ140001 St John's Laboratory 300 µg 324 EUR

mCherry-Tag Antibody
T0090 Affbiotech 1ml 420 EUR

Anti-mCherry antibody
STJ97027 St John's Laboratory 200 µl 236.4 EUR

Anti-HIV Type 1 gp41 Clone 10E9 (100 µg)
0801006 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p17 Clone 2D11 (100 µg)
0801076 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 gp41 Clone 10E9 (100 µg)
801006 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HIV Type 1 p17 Clone 2D11 (100 µg)
801076 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

S-100 Antibody
3958-100 Biovision each 379.2 EUR

mCherry-Chicken
CH22115 Neuromics 100 ul 522 EUR

mCherry - Mouse
MO22140 Neuromics 100 ul 522 EUR

mCherry-Rabbit
RA22117 Neuromics 100 ul 522 EUR

pAX01-mCherry
PVT17868 Lifescience Market 2 ug 508.8 EUR

pNanog- mCherry
PVT10426 Lifescience Market 2 ug 319.2 EUR

pDawn- mCherry
PVT10619 Lifescience Market 2 ug 361.2 EUR

pBV220- mCherry
PVT10620 Lifescience Market 2 ug 361.2 EUR

pRSETB- mCherry
PVT10624 Lifescience Market 2 ug 361.2 EUR

pCDNA3.1- mCherry
PVT10770 Lifescience Market 2 ug 319.2 EUR

pT2- mCherry
PVT10881 Lifescience Market 2 ug 361.2 EUR

pLV- mCherry
PVT11094 Lifescience Market 2 ug 361.2 EUR

pUC35s- mCherry
PVT11192 Lifescience Market 2 ug 319.2 EUR

pCAMBIA1300-mCherry
PVT12181 Lifescience Market 2 ug 1093.2 EUR

pUC19-mCherry
PVT13738 Lifescience Market 2 ug 843.6 EUR

pET28a- mCherry
PVT0075 Lifescience Market 2 ug 307.2 EUR

Anti-HTLV Type I p19 Clone TP-7 (100 µg)
0801003 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 38/8.7.47 (100 µg)
0801004 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p17 Clone 32/5.8.42 (100 µg)
0801005 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 RT Clone 39/4.12.2 (100 µg)
0801007 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HTLV Type I p24 Clone 46/3.24.4 (100 µg)
0801018 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p17 Clone 32/1.24.89 (100 µg)
0801077 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 32/5.17.76 (100 µg)
0801078 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 39/5.1.23 (100 µg)
0801079 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 39/5.4A (100 µg)
0801080 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 39/6.14 (100 µg)
0801081 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HTLV Type I p19 Clone 45/6.11.1.3 (100 µg)
0801082 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HTLV Type I gp46 Clone 67/5.5.13.1 (100 µg)
0801084 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HTLV Type I gp46 Clone 68/4.11.21 (100 µg)
0801085 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HTLV Type II gp46 Clone 73/4.9.8 (100 µg)
0801086 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HTLV Type II p24 Clone 75/4.21.11 (100 µg)
0801087 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HTLV Type II p19 Clone 78/6.18.07 (100 µg)
0801093 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

LIMITED QTY-rhIL-2 Recombinant Human Interleukin-2 (100 µg)
0802001 Zeptometrix 100 µg 434.4 EUR

Anti-HTLV Type I gp46 Clone 65/6C2.2.34 (100 µg)
0802004 Zeptometrix 100 µg 340.8 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 38/8.7.47 (100 µg)
801004 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HIV Type 1 p17 Clone 32/5.8.42 (100 µg)
801005 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HIV Type 1 RT Clone 39/4.12.2 (100 µg)
801007 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HTLV Type I p24 Clone 46/3.24.4 (100 µg)
801018 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HIV Type 1 p17 Clone 32/1.24.89 (100 µg)
801077 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 32/5.17.76 (100 µg)
801078 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 39/5.4A (100 µg)
801080 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 39/6.14 (100 µg)
801081 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HTLV Type I p19 Clone 45/6.11.1.3 (100 µg)
801082 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HTLV Type I gp46 Clone 67/5.5.13.1 (100 µg)
801084 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HTLV Type I gp46 Clone 68/4.11.21 (100 µg)
801085 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HTLV Type II gp46 Clone 73/4.9.8 (100 µg)
801086 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HTLV Type II p24 Clone 75/4.21.11 (100 µg)
801087 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

Anti-HTLV Type II p19 Clone 78/6.18.07 (100 µg)
801093 Zeptometrix 100 µg 278 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Plasma, 2 vials)
M1041-2 Biovision each 853.2 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Plasma, 4 vials)
M1041-4 Biovision each 1364.4 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Plasma, 6 vials)
M1041-6 Biovision each 1886.4 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Serum, 2 vials)
M1043-2 Biovision each 855.6 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Serum, 4 vials)
M1043-4 Biovision each 1358.4 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Serum, 6 vials)
M1043-6 Biovision each 1886.4 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Urine, 2 vials)
M1045-2 Biovision each 848.4 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Urine, 4 vials)
M1045-4 Biovision each 1364.4 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Urine, 6 vials)
M1045-6 Biovision each 1886.4 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Saliva, 2 vials)
M1047-2 Biovision each 874.8 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Saliva, 4 vials)
M1047-4 Biovision each 1364.4 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Saliva, 6 vials)
M1047-6 Biovision each 1945.2 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, U87 MG, 2 vials)
M1055-2 Biovision each 861.6 EUR
Agonista DREADD C21 (związek 21) nie miał wpływu na kontekstowe warunkowanie strachu lub ekspresję c-Fos w komórkach DIO-hM3Dq- mCherry +  myszy C57BL/6J. Łącznie nasze wyniki wskazują, że konstrukty DIO mają ekspresję odbiegającą od celu u osobników typu dzikiego. Nasze odkrycia są szczególnie ważne przy projektowaniu eksperymentów z czułymi systemami i/lub pomiarami ilościowymi, na które może mieć negatywny wpływ ekspresja odbiegająca od celu.
Stwierdzenie istotności Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są szeroko stosowane w neuronauce ze względu na ich bezpieczeństwo i łatwość użycia. W połączeniu ze specyficznymi promotorami, Cre/loxP i zastrzykami stereotaktycznymi można osiągnąć wysoce specyficzne celowanie w komórki i obwody w mózgu. W niniejszym badaniu wstrzyknęliśmy AAV zależne od Cre myszom C57BL/6J typu dzikiego i stwierdziliśmy niezależną od Cre ekspresję wirusową AAV kodujących  mCherry , GFP lub hM3Dq po immunohistochemicznej amplifikacji fluorescencyjnego białka reporterowego.
Co ważne, nie zaobserwowaliśmy żadnego funkcjonalnego wpływu ekspresji niezależnej od Cre w hipokampie, ponieważ C21 (związek 21) nie miał wykrywalnego wpływu na neurony zakażone podwójnie odwróconą otwartą ramką odczytu (DIO)-hM3Dq – mCherry u myszy C57BL/6J. Biorąc pod uwagę powszechne stosowanie rekombinowanych AAV DIO przez społeczność neuronaukową, nasze dane potwierdzają staranne rozważenie przy stosowaniu konstruktów DIO u zwierząt kontrolnych.

Dodaj komentarz