Programowanie ex vivo komórek T może być skuteczne, ale jest złożone i kosztowne; dlatego ważne jest opracowanie metod transfekcji komórek T in situ. Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy nanocząstki lipidowe skierowane przeciwko CD3 (aCD3-LNP), aby dostarczać ciasno upakowane mRNA genu reporterowego specyficznie do komórek T. In vitro ukierunkowane LNP skutecznie dostarczały mRNA mCherry do limfocytów T Jurkat, a aktywacja i eliminacja limfocytów T była związana z powlekaniem przeciwciałem aCD3 na powierzchni LNP. aCD3-LNP, ale nie nieukierunkowane LNP, akumulowały się w śledzionie po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym, z sygnałami mCherry i Fluc widocznymi w ciągu 30 minut po wstrzyknięciu.W 24 h po wstrzyknięciu aCD3-LNP, 2-4% wszystkich limfocytów T śledziony i 2-7% wszystkich krążących limfocytów T eksprymowało mCherry , a to zależało od gęstości powłoki aCD3.
Ukierunkowaniu i transfekcji towarzyszyła ogólnoustrojowa aktywacja limfocytów T CD25 + , OX40 + i CD69 + z przejściową utratą liganda CD3e oraz zubożeniem podzbiorów śledziony i krążących. Migracja śledziony CD8a + Limfocyty T z miazgi białej do miazgi czerwonej i różnicowanie od fenotypów naiwnych do fenotypów pamięciowych i efektorowych, następowało po dostarczeniu aCD3-LNP. Dodatkowo wstrzyknięcie aCD3-LNP stymulowało wydzielanie do osocza chemokin pochodzenia szpikowego i cytokin T-pomocniczych. Na koniec podaliśmy aCD3-LNP myszom z nowotworem i stwierdziliśmy, że transfekowane limfocyty T zlokalizowane w guzach i węzłach chłonnych drenujących nowotwór po leczeniu immunoterapią. Podsumowując, pokazujemy, że transfekcja ukierunkowana na CD3 jest możliwa, ale wiąże się ze złożonymi konsekwencjami immunologicznymi, które muszą być dalej badane pod kątem potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Wpływ modyfikacji molekularnej na skuteczność inwazji rekombinowanych wektorów bakulowirusowych na komórki ssaków i jego immunogenność u myszy
System wyświetlania bakulowirusa (BDS), doskonała technologia wyświetlania powierzchni eukariotycznych, która oferuje zalety bezpieczeństwa, wydajności i oszczędności, jest szeroko stosowana w biomedycynie. Wcześniejsze badanie z użyciem rBacmid-Δgp64-ires-gp64 eksprymowanego w małej liczbie kopii genu gp64 osiągnęło wysoką wydajność ekspresji i koekspozycji trzech białek fluorescencyjnych (GFP, YFP i mCherry ).
mCherry Antibody 100 µg
- Jednak niska ekspresja GP64 w rekombinowanych bakulowirusach zmniejsza również wydajność transdukcji rekombinowanego bakulowirusa do komórek ssaków. Ponadto promotor bakulowirusa nie wykazuje aktywności ekspresyjnej w komórkach ssaków, a zatem nie może spełniać wymagań aplikacyjnych wektorów bakulowirusowych dla BDS .
- W oparciu o wcześniejsze badania, w ramach tego badania najpierw określono aktywność ekspresyjną promotorów w komórkach owadów Spodoptera frugiperda 9 i komórkach ssaków, a także pomyślnie przebadano bardzo wczesny promotor pie1 , aby pośredniczyć w koekspresji wielu genów.
- Po drugie, wykorzystując efekt prezentacji otoczki białek INVASIN i VSVG, wydajność transdukcji rekombinowanych cząstek bakulowirusa do komórek nie-gospodarza została znacznie poprawiona.
- Ostatecznie, w oparciu o powyższe ulepszenie, skonstruowano zrekombinowany wektor bakulowirusowy prezentujący cztery białka antygenowe z wysoką wydajnością. W porównaniu z tradycyjnymi BDS, system rBacmid-Δgp64 wykazywał zwiększoną wydajność prezentacji białka docelowego około 3-krotnie i indukował około 4-krotny wzrost miana przeciwciał surowicy przeciwko antygenom docelowym u myszy Bal B/c.
- W ramach tego badania systematycznie badano zastosowanie nowej technologii współwyświetlania wielu genów w badaniach nad wieloma szczepionkami, a wyniki stanowią podstawę do opracowania nowatorskich technologii BDS.
Zaburzenie funkcji kinetochoru za pomocą białka wiążącego GFP w drożdżach rozszczepiających
Wykorzystanie mutacji genetycznych do badania funkcji białek in vivo to centralny paradygmat współczesnej biologii. Jednodomenowe przeciwciała wielbłądowatych wytworzone przeciwko GFP zostały zaprojektowane jako nanociała lub białka wiążące GFP (GBP), które mogą wiązać GFP, a także niektóre warianty GFP z wysokim powinowactwem i selektywnością. W tym badaniu wykorzystaliśmy białko fuzyjne GBP-mCherry jako narzędzie do zakłócania naturalnych funkcji kilku białek kinetochorowych w drożdżach rozszczepialnych Schizosaccharomyces pombe.
Odkryliśmy, że komórki jednocześnie eksprymujące GBP – mCherry i znakowane GFP białko Cnp1 wewnętrznego kinetochoru są wrażliwe na wysoką temperaturę i mikrotubulowy lek, tiabendazol (TBZ). Ponadto, GBP-mCherry ukierunkowany na kinetochor przez kilka głównych białek kinetochorowych ze znacznikami GFP powoduje defekty w wiernej segregacji chromosomów. W związku z tym to ustawienie narusza funkcje kinetochorów i powoduje, że komórki zachowują się jak mutanty warunkowe.
Nasze badanie podkreśla potencjał wykorzystania GBP jako ogólnego narzędzia do zakłócania funkcji niektórych białek znakowanych GFP in vivo w celu zrozumienia ich funkcjonalnego znaczenia dla niektórych procesów fizjologicznych, nie tylko u drożdży, ale także potencjalnie w innych układach modelowych.
NIEDOCELOWA EKSPRESJA WIRUSÓW ZALEŻNYCH OD CRE I ZWIĄZANYCH Z ADENOWIRUSAMI U MYSZY TYPU DZIKIEGO C57BL/6J
Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są powszechnie używanym narzędziem w neuronauce do skutecznego znakowania, śledzenia i/lub manipulowania populacjami neuronów. Wysoce specyficzne ukierunkowanie można osiągnąć poprzez AAV zależne od rekombinazy w połączeniu z transgenicznymi liniami gryzoni, które wyrażają rekombinazę Cre w określonych typach komórek. Wizualizację ekspresji wirusa zazwyczaj uzyskuje się za pomocą fluorescencyjnych białek reporterowych (np. GFP lub mCherry ) upakowanych w genomie AAV. Chociaż nieamplifikowana fluorescencja jest zwykle wystarczająca do zaobserwowania ekspresji wirusa, immunohistochemiczna amplifikacja reportera fluorescencyjnego jest rutynowo stosowana w celu poprawy wizualizacji wirusa. W niniejszym badaniu AAV zależne od Cre wstrzyknięto do kory nowej myszy C57BL/6J typu dzikiego.
Chociaż obserwowaliśmy słabą, ale spójną nieamplifikowaną ekspresję podwójnej odwróconej otwartej ramki odczytu (DIO) poza docelowym celem u myszy C57BL/6J, amplifikacja przeciwciała reportera GFP lub mCherry ujawniła zauważalną niezależną od Cre ekspresję wirusa. Niedocelowa ekspresja konstruktów DIO u myszy C57BL/6J typu dzikiego występowała niezależnie od dostawcy, serotypu AAV lub promotora. Oceniliśmy również, czy ekspresja niezależna od Cre ma działanie funkcjonalne poprzez receptory projektowane aktywowane wyłącznie przez leki projektowane (DREADD).
mCherry Antibody |
|||
| abx332840-100ul | Abbexa | 100 ul | 510 EUR |
mCherry Antibody |
|||
| 5993-100 | Biovision | each | 483.6 EUR |
mCherry Antibody |
|||
| 5993-30T | Biovision | each | 175.2 EUR |
mCherry antibody |
|||
| 70R-12458 | Fitzgerald | 100 ug | 632.4 EUR |
mCherry Antibody |
|||
| 20-abx159607 | Abbexa |
|
|
mCherry tag Antibody |
|||
| abx019132-100ug | Abbexa | 100 ug | 427.2 EUR |
mCherry-tag Antibody |
|||
| 20-abx134448 | Abbexa |
|
|
mCherry-tag Antibody |
|||
| 20-abx134449 | Abbexa |
|
|
mCherry-tag Antibody |
|||
| 20-abx134450 | Abbexa |
|
|
mCherry-Tag Antibody |
|||
| 20-abx242885 | Abbexa |
|
|
mCherry-Tag Antibody |
|||
| 20-abx330249 | Abbexa |
|
|
mCherry-Tag Antibody |
|||
| 20-abx330282 | Abbexa |
|
|
mCherry-Tag Antibody |
|||
| 1-CSB-PA000343 | Cusabio |
|
|
mCherry-Tag Antibody |
|||
| T0090 | Affbiotech | 1ml | 420 EUR |
mCherry Monoclonal Antibody |
|||
| ABM40125-003ml | Abbkine | 0.03ml | 189.6 EUR |
mCherry Monoclonal Antibody |
|||
| ABM40125-01ml | Abbkine | 0.1ml | 346.8 EUR |
mCherry Monoclonal Antibody |
|||
| ABM40125-02ml | Abbkine | 0.2ml | 496.8 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D | Stressmarq | 0.1ml | 376.8 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-A390 | Stressmarq | 0.1ml | 433.2 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-A488 | Stressmarq | 0.1ml | 432 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-A565 | Stressmarq | 0.1ml | 432 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-A594 | Stressmarq | 0.1ml | 432 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-A633 | Stressmarq | 0.1ml | 432 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-A655 | Stressmarq | 0.1ml | 432 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-A680 | Stressmarq | 0.1ml | 432 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-A700 | Stressmarq | 0.1ml | 432 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-ALP | Stressmarq | 0.1ml | 426 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-APC | Stressmarq | 0.1ml | 430.8 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-APCCY7 | Stressmarq | 0.1ml | 518.4 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-BI | Stressmarq | 0.1ml | 428.4 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-DY350 | Stressmarq | 0.1ml | 523.2 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-DY405 | Stressmarq | 0.1ml | 494.4 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-DY488 | Stressmarq | 0.1ml | 471.6 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-DY594 | Stressmarq | 0.1ml | 476.4 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-DY633 | Stressmarq | 0.1ml | 464.4 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-FITC | Stressmarq | 0.1ml | 423.6 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-HRP | Stressmarq | 0.1ml | 418.8 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-P594 | Stressmarq | 0.1ml | 440.4 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-PCP | Stressmarq | 0.1ml | 430.8 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-RPE | Stressmarq | 0.1ml | 429.6 EUR |
Mouse antibody for mCherry |
|||
| SPC-1268D-STR | Stressmarq | 0.1ml | 430.8 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| ABP50148-003ml | Abbkine | 0.03ml | 189.6 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| ABP50148-01ml | Abbkine | 0.1ml | 346.8 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| ABP50148-02ml | Abbkine | 0.2ml | 496.8 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| ABM40176-003ml | Abbkine | 0.03ml | 189.6 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| ABM40176-01ml | Abbkine | 0.1ml | 346.8 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| ABM40176-02ml | Abbkine | 0.2ml | 496.8 EUR |
mCherry Mouse Polyclonal Antibody |
|||
| CSB-PA254229- | Cusabio | each | 402 EUR |
mCherry Mouse Polyclonal Antibody |
|||
| CSB-PA254229-100ul | Cusabio | 100ul | 379.2 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| 1-CSB-PA000348 | Cusabio |
|
|
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| ES1147-100ul | ELK Biotech | 100ul | 334.8 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| ES1147-50ul | ELK Biotech | 50ul | 248.4 EUR |
mCherry-Tag Monoclonal Antibody |
|||
| EM1009-100ul | ELK Biotech | 100ul | 334.8 EUR |
mCherry-Tag Monoclonal Antibody |
|||
| EM1009-50ul | ELK Biotech | 50ul | 248.4 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| EA007-100ul | ELK Biotech | 100ul | 334.8 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| EA007-50ul | ELK Biotech | 50ul | 248.4 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| EA012-100ul | ELK Biotech | 100ul | 334.8 EUR |
mCherry-Tag Polyclonal Antibody |
|||
| EA012-50ul | ELK Biotech | 50ul | 248.4 EUR |
mCherry Mouse Polyclonal Antibody |
|||
| T513-100ul | SAB | 100ul | 302.4 EUR |
mCherry Mouse Polyclonal Antibody |
|||
| T513-50ul | SAB | 50ul | 224.4 EUR |
mCherry Mouse Monoclonal Antibody |
|||
| T515-100ul | SAB | 100ul | 302.4 EUR |
mCherry Mouse Monoclonal Antibody |
|||
| T515-50ul | SAB | 50ul | 224.4 EUR |
mCherry |
|||
| MO22192 | Neuromics | 100 ul | 522 EUR |
mCherry- Tag Mouse Monoclonal Antibody |
|||
| T0013 | Lifescience Market | 100 ug | 525.6 EUR |
mCherry -Tag Rabbit Polyclonal Antibody |
|||
| T521-100ul | SAB | 100ul | 302.4 EUR |
mCherry -Tag Rabbit Polyclonal Antibody |
|||
| T521-50ul | SAB | 50ul | 224.4 EUR |
mCherry-Tag Mouse Monoclonal Antibody |
|||
| T602-100ul | SAB | 100ul | 302.4 EUR |
mCherry-Tag Mouse Monoclonal Antibody |
|||
| T602-50ul | SAB | 50ul | 224.4 EUR |
mCherry Tag Mouse Monoclonal Antibody (9D3) |
|||
| A02080-005ml | Abbkine | 0.05ml | 176.4 EUR |
mCherry Tag Mouse Monoclonal Antibody (9D3) |
|||
| A02080-02ml | Abbkine | 0.2ml | 398.4 EUR |
mCherry Tag Mouse Monoclonal Antibody (9D3) |
|||
| A02080-02ml5 | Abbkine | 0.2ml×5 | 1104 EUR |
mCherry Tag Mouse Monoclonal Antibody (9D3) |
|||
| A02080HRP-005ml | Abbkine | 0.05ml | 216 EUR |
mCherry Tag Mouse Monoclonal Antibody (9D3) |
|||
| A02080HRP-02ml | Abbkine | 0.2ml | 477.6 EUR |
mCherry Tag Mouse Monoclonal Antibody (9D3) |
|||
| A02080HRP-02ml5 | Abbkine | 0.2ml×5 | 1518 EUR |
pT2- mCherry |
|||
| PVT10881 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
pLV- mCherry |
|||
| PVT11094 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
mCherry - Mouse |
|||
| MO22140 | Neuromics | 100 ul | 522 EUR |
pDawn- mCherry |
|||
| PVT10619 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
pET28a- mCherry |
|||
| PVT0075 | Lifescience Market | 2 ug | 307.2 EUR |
pNanog- mCherry |
|||
| PVT10426 | Lifescience Market | 2 ug | 319.2 EUR |
pBV220- mCherry |
|||
| PVT10620 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
pRSETB- mCherry |
|||
| PVT10624 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
pCDNA3.1- mCherry |
|||
| PVT10770 | Lifescience Market | 2 ug | 319.2 EUR |
pUC35s- mCherry |
|||
| PVT11192 | Lifescience Market | 2 ug | 319.2 EUR |
mCherry-Rabbit |
|||
| RA22117 | Neuromics | 100 ul | 522 EUR |
PA- mCherry- C1 |
|||
| PVT10759 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
PA- mCherry- N1 |
|||
| PVT10760 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
mCherry-Chicken |
|||
| CH22115 | Neuromics | 100 ul | 522 EUR |
pLVX- mCherry- N1 |
|||
| PVT11067 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
pLVX- mCherry- C1 |
|||
| PVT11068 | Lifescience Market | 2 ug | 444 EUR |
pUC57- Tac- mCherry |
|||
| PVT10621 | Lifescience Market | 2 ug | 444 EUR |
pCAS9- mCherry empty |
|||
| PVT10985 | Lifescience Market | 2 ug | 319.2 EUR |
pUC57- mCherry Plasmid |
|||
| PVT0008 | Lifescience Market | 2 ug | 390 EUR |
pBBR1MCS2- Tac- mCherry |
|||
| PVT11376 | Lifescience Market | 2 ug | 444 EUR |
pET28a- mCherry Plasmid |
|||
| PVT0334 | Lifescience Market | 2 ug | 307.2 EUR |
pBI121- mCherry Plasmid |
|||
| PVT3005 | Lifescience Market | 2 ug | 289.2 EUR |
pBARGPE1- mCherry Plasmid |
|||
| PVT5308 | Lifescience Market | 2 ug | 390 EUR |
Mouse anti mCherry-Tag mAb |
|||
| AE002 | Abclonal | 50 ul | 267.6 EUR |
mCherry- Tubulin- C- 18 |
|||
| PVT10163 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
pHDE- 35s- Cas9- mCherry |
|||
| PVT11215 | Lifescience Market | 2 ug | 361.2 EUR |
Agonista DREADD C21 (związek 21) nie miał wpływu na kontekstowe warunkowanie strachu lub ekspresję c-Fos w komórkach DIO-hM3Dq- mCherry + myszy C57BL/6J. Łącznie nasze wyniki wskazują, że konstrukty DIO mają ekspresję odbiegającą od celu u osobników typu dzikiego. Nasze odkrycia są szczególnie ważne przy projektowaniu eksperymentów z czułymi systemami i/lub pomiarami ilościowymi, na które może mieć negatywny wpływ ekspresja odbiegająca od celu.
Stwierdzenie istotności Wirusy związane z adenowirusami (AAV) są szeroko stosowane w neuronauce ze względu na ich bezpieczeństwo i łatwość użycia. W połączeniu ze specyficznymi promotorami, Cre/loxP i zastrzykami stereotaktycznymi można osiągnąć wysoce specyficzne celowanie w komórki i obwody w mózgu. W niniejszym badaniu wstrzyknęliśmy AAV zależne od Cre myszom C57BL/6J typu dzikiego i stwierdziliśmy niezależną od Cre ekspresję wirusową AAV kodujących mCherry , GFP lub hM3Dq po immunohistochemicznej amplifikacji fluorescencyjnego białka reporterowego.
Co ważne, nie zaobserwowaliśmy żadnego funkcjonalnego wpływu ekspresji niezależnej od Cre w hipokampie, ponieważ C21 (związek 21) nie miał wykrywalnego wpływu na neurony zakażone podwójnie odwróconą otwartą ramką odczytu (DIO)-hM3Dq – mCherry u myszy C57BL/6J. Biorąc pod uwagę powszechne stosowanie rekombinowanych AAV DIO przez społeczność neuronaukową, nasze dane potwierdzają staranne rozważenie przy stosowaniu konstruktów DIO u zwierząt kontrolnych.
Dodaj komentarz