Opisano prostą, in vitro, opartą na rozcieńczaniu barwników metodę pomiaru proliferacji limfocytów T CD4 + swoistej dla antygenu w ludzkich jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC). Opracowanie stabilnych, nietoksycznych barwników fluorescencyjnych, takich jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), pozwala na odróżnienie rzadkich, specyficznych dla antygenu limfocytów T od osób postronnych poprzez zmniejszenie barwienia fluorescencyjnego, co wykrywa się za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda ma następujące zalety w porównaniu z podejściami alternatywnymi: (i) jest bardzo wrażliwa na komórki T o niskiej częstotliwości, (ii) nie jest wymagana wiedza o antygenie lub epitopie, (iii) można analizować fenotyp komórek odpowiadających, oraz (iv) żywotne, odpowiadające komórki można sortować i stosować do dalszej analizy, takiej jak klonowanie komórek T.
Wykorzystanie estru sukcynoimidylowego karboksyfluoresceiny ( CFSE ) do identyfikacji nieaktywnych komórek macierzystych podobnych do glejaka.
Oporność nowotworu na konwencjonalne terapie jest głównym wyzwaniem w walce z rakiem, chorobą zagrażającą życiu. Ta oporność wynika głównie z heterogeniczności guza, a dokładniej z istnienia komórek „podobnych do macierzystych”, które pozostają w stanie spoczynku przez długi czas i w ten sposób unikają powszechnie stosowanych leków przeciwnowotworowych, co skutkuje niepowodzeniem leczenia. Dlatego celowanie w tę subpopulację stanowiłoby realną strategię przezwyciężenia obciążenia guzem.
To zniechęcające zadanie wymaga głębokiego i dokładnego zrozumienia biologii populacji komórek macierzystych w stanie spoczynku, ich interakcji z mikrośrodowiskiem guza oraz mechanizmów wykorzystywanych do utrzymania się pomimo agresywnych terapii. W tym rozdziale opisujemy szczegółowe procedury techniczne izolacji nieaktywnych lub rzadko dzielących się komórek macierzystych z hodowanych komórek guza glejaka za pomocą barwienia estru sukcynoimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) i analizy metodą cytometrii przepływowej. Nieaktywne komórki glejaka o cechach podobnych do macierzystych są charakteryzowane, a następnie izolowane w oparciu o ich zdolność do zachowywania znakowania CFSE.
Znaczenie kliniczne mikrosfer znakowanych estrem sukcynoimidylowym 5-(i 6)-karboksyfluoresceiny w wykrywaniu śródbłonkowych komórek progenitorowych w ludzkiej krwi obwodowej
Celem niniejszego badania było ustalenie jednoplatformowej metody cytometrii przepływowej z zastosowaniem mikrosfer znakowanych estrem sukcynoimidylowym (CFSE) 5-(i 6)-karboksyfluoresceiny jako odniesienia do określania liczby komórek progenitorowych śródbłonka (EPC) oraz ocena skuteczność tej metody wykrywania. Do zliczania liczby komórek przy użyciu mikrokulek fluorescencyjnych barwionych CFSE jako wewnętrznego odniesienia zastosowano jednoplatformową cytometrię przepływową, a liczby EPC w próbkach przy użyciu tej nowej metody porównano z testem zliczania klonogennego in vitro.
Wyniki dwóch metod zliczania były zgodne i porównane z testem zliczania klonogennego in vitro, czas i koszt nowej metody zostały znacznie zmniejszone, podobnie jak odpowiednie wymagania techniczne. Obecne odkrycia wskazują, że jednoplatformowa cytometria przepływowa, z mikrosferami znakowanymi CFSE jako odniesieniem, zapewnia szybsze i lepsze wykrywanie EPC w próbkach ludzkiej krwi obwodowej przy skróconym czasie i kosztach, co czyni ją bardziej odpowiednią do rutynowych zastosowań klinicznych.
PacBlue succinimidyl ester
Wykorzystanie estru sukcynoimidylowego dioctanu karboksyfluoresceiny do monitorowania wewnątrzkomórkowej glikacji białek.
Glikacja białek jest wszechobecnym procesem związanym z powikłaniami naczyniowymi obserwowanymi w cukrzycy. Glyoxal (GO), wewnątrzkomórkowy reaktywny oksoaldehyd, który jest jednym z najsilniejszych czynników glikacji, łatwo reaguje z aminami obecnymi na białkach, tworząc pochodzący z lizyny addukt karboksymetylolizyny, który jest dominującym produktem końcowym zaawansowanej glikacji (AGE). Nasza grupa wykazała wcześniej, że ekspozycja komórek na GO prowadzi do zmiany aktywności skurczowej komórek, która może wystąpić w wyniku glikacji różnych białek regulujących maszynerię kurczliwości komórek.
Tutaj zmierzyliśmy zakres glikacji trzech funkcjonalnie odrębnych białek, o których wiadomo, że uczestniczą w skurczu komórek i organizacji cytoszkieletu – kinazie Rho (ROCK), aktynie i gelsolinie (GSN) – przy użyciu testu opartego na reakcji błony komórkowej – przepuszczalna sonda fluorescencyjna karboksyfluoresceinaester sukcynoimidylowy dioctanu (CFDA-SE), który reaguje z pierwszorzędowymi grupami aminowymi białek. Łącząc fluorescencję CFDA-SE i wykrywanie Western blot, zaobserwowaliśmy (po inkubacji GO) zwiększoną glikację aktyny i ROCK, jak również zwiększoną interakcję między aktyną i GSN, obserwowaną przez koimmunoprecypitację. Zatem dochodzimy do wniosku, że zastosowanie sondy fluorescencyjnej CFDA-SE stanowi interesującą alternatywę do przeprowadzenia analizy porównawczej stopnia wewnątrzkomórkowej glikacji białek w żywych komórkach.
Metoda znakowania estrów sukcynoimidylowych dioctanu karboksyfluoresceiny w celu zbadania interakcji między Leptospira i makrofagami
Leptospiroza, wywoływana przez patogenne gatunki z rodzaju Leptospira, stała się jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób odzwierzęcych na świecie. Dokładny mechanizm patogenezy pozostaje nieznany, a interakcja między Leptospira i makrofagami nie jest dobrze poznana. W tym badaniu donosimy, że ester sukcynoimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDA-SE) może skutecznie znakować różne szczepy Leptospira interrogans bez wpływu na ruchliwość, żywotność lub zjadliwość bakterii.
Po wspólnej inkubacji leptospirale znakowane CFDA-SE związane z makrofagami oznaczono ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii konfokalnej. Ponadto wykazaliśmy, że błękit trypanowy skutecznie tłumił pozakomórkową fluorescencję przylegających leptospirów, co umożliwiło rozróżnienie bakterii wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych.
CHEMIA POWIERZCHNI ESTRÓW SUKCYNOIMIDYLOWYCH : IMPLIKACJE KONKURENCJI MIĘDZY AMINOLIZĄ I HYDROLIZĄ NA KOWALENCYJNE UNIERUCHOMIENIE BIAŁEK
Estrowe grupy końcowe N-hydroksysukcynoimidu (NHS) są powszechnie stosowane do kowalencyjnego sprzęgania biocząsteczek zawierających aminy (np. białek i peptydów) z powierzchniami poprzez wiązania amidowe. Ta jednoetapowa aminoliza jest często przeprowadzana w zbuforowanych roztworach wodnych w pobliżu fizjologicznego pH (pH 6 do pH 9). W tych warunkach hydroliza grupy estrowej konkuruje z procesem amidowania, potencjalnie obniżając wydajność chemii sprzęgania. W pracy zbadano skuteczność immobilizacji białek kowalencyjnych w buforze boranowym (50 mM, pH 8,50) przy użyciu monowarstwy tiolanowej utworzonej przez chemisorpcjęditiobis (propionian sukcynoimidylowy) (DSP) na złocie. Strukturę i reaktywność tych warstw ad-warstw ocenia się za pomocą spektroskopii w podczerwieni (IR), rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS), elektrochemicznej desorpcji redukcyjnej i pomiarów kąta zwilżania.
PacBlue succinimidyl ester [equivalent to Pacific Blue succinimidyl ester] |
|||
| 570 | AAT Bioquest | 5 mg | 262.8 EUR |
AMCA, succinimidyl ester |
|||
| 502 | AAT Bioquest | 10 mg | 158.4 EUR |
Cy3NS succinimidyl ester |
|||
| 191 | AAT Bioquest | 25 mg | 367.2 EUR |
CFQ520 succinimidyl ester |
|||
| 80500 | Biotium | 5MG | 332.4 EUR |
CF514 succinimidyl ester |
|||
| 92103 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF532 succinimidyl ester |
|||
| 92104 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF543 succinimidyl ester |
|||
| 92105 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF620R succinimidyl ester |
|||
| 92106 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF680R succinimidyl ester |
|||
| 92107 | Biotium | 1UMOL | 410.4 EUR |
CF640R succinimidyl ester |
|||
| 92108 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF350 succinimidyl ester |
|||
| 92109 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF405M succinimidyl ester |
|||
| 92111 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF405L succinimidyl ester |
|||
| 92112 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF430 succinimidyl ester |
|||
| 92117 | Biotium | 1UMOL | 381.6 EUR |
CF488A, succinimidyl ester |
|||
| 92120 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF440 succinimidyl ester |
|||
| 92123 | Biotium | 1UMOL | 381.6 EUR |
CF800 succinimidyl ester |
|||
| 92127 | Biotium | 0,25UMOL | 283.2 EUR |
CF555, succinimidyl ester |
|||
| 92130 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF568 succinimidyl ester |
|||
| 92131 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF594 succinimidyl ester |
|||
| 92132 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF633 succinimidyl ester |
|||
| 92133 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF660R succinimidyl ester |
|||
| 92134 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF647, succinimidyl ester |
|||
| 92135 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF660C, succinimidyl ester |
|||
| 92137 | Biotium | 1UMOL | 374.4 EUR |
CF680, succinimidyl ester |
|||
| 92139 | Biotium | 1UMOL | 396 EUR |
CF750, succinimidyl ester |
|||
| 92142 | Biotium | 1UMOL | 396 EUR |
CF770, succinimidyl ester |
|||
| 92150 | Biotium | 1UMOL | 396 EUR |
CF790 succinimidyl ester |
|||
| 92155 | Biotium | 0.25UMOL | 255.6 EUR |
CF570 succinimidyl ester |
|||
| 96014 | Biotium | 1UMOL | 393.6 EUR |
CF583 succinimidyl ester |
|||
| 96016 | Biotium | 1UMOL | 393.6 EUR |
CF700 succinimidyl ester |
|||
| 96067 | Biotium | 1UMOL | 448.8 EUR |
CF820 succinimidyl ester |
|||
| 96068 | Biotium | 0.25UMOL | 292.8 EUR |
BG Succinimidyl Ester |
|||
| 12564 | AAT Bioquest | 1 mg | 211 EUR |
BC Succinimidyl Ester |
|||
| 12565 | AAT Bioquest | 1 mg | 211 EUR |
NTA succinimidyl ester |
|||
| 12608 | AAT Bioquest | 5 mg | 203 EUR |
IDA succinimidyl ester |
|||
| 12632 | AAT Bioquest | 5 mg | 308 EUR |
Estradiol succinimidyl ester |
|||
| 50545 | AAT Bioquest | 1 mg | 102 EUR |
Fentanyl succinimidyl ester |
|||
| 50560 | AAT Bioquest | 1 mg | 532 EUR |
MCA succinimidyl ester [7-Methoxycoumarin-4-acetic acid, succinimidyl ester] |
|||
| 558 | AAT Bioquest | 25 mg | 211.2 EUR |
RuFluor™ succinimidyl ester |
|||
| 1520 | AAT Bioquest | 1 mg | 471.6 EUR |
Thioflavin T, succinimidyl ester |
|||
| 23065 | AAT Bioquest | 5 mg | 262.8 EUR |
Cyanine 555 succinimidyl ester |
|||
| 9-90016 | Biotium |
|
|
Cyanine 647 succinimidyl ester |
|||
| 9-90025 | Biotium |
|
|
Cyanine 680 succinimidyl ester |
|||
| 9-90048 | Biotium |
|
|
Cyanine 750 succinimidyl ester |
|||
| 9-90049 | Biotium |
|
|
Cyanine 488NS succinimidyl ester |
|||
| 90117-1mg | Biotium | 1MG | 199.2 EUR |
Cyanine 555NS succinimidyl ester |
|||
| 90118-1mg | Biotium | 1MG | 199.2 EUR |
Cyanine 647NS succinimidyl ester |
|||
| 90119-1mg | Biotium | 1MG | 199.2 EUR |
AzoDye-1 Succinimidyl Ester |
|||
| 2402 | AAT Bioquest | 5 mg | 102 EUR |
AzoDye-2 Succinimidyl Ester |
|||
| 2422 | AAT Bioquest | 5 mg | 102 EUR |
AzoDye-3 Succinimidyl Ester |
|||
| 2472 | AAT Bioquest | 5 mg | 97 EUR |
5-dR6G, succinimidyl ester |
|||
| 302 | AAT Bioquest | 5 mg | 3162 EUR |
5-dTMR, succinimidyl ester |
|||
| 307 | AAT Bioquest | 5 mg | 2091 EUR |
5-dROX, succinimidyl ester |
|||
| 312 | AAT Bioquest | 5 mg | 2091 EUR |
5-dR110, succinimidyl ester |
|||
| 317 | AAT Bioquest | 5 mg | 5306 EUR |
iFluor™ 790 succinimidyl ester |
|||
| 1368 | AAT Bioquest | 1 mg | 262.8 EUR |
iFluor™ 800 succinimidyl ester |
|||
| 1379 | AAT Bioquest | 1 mg | 367.2 EUR |
iFluor™ 810 succinimidyl ester |
|||
| 1389 | AAT Bioquest | 1 mg | 367.2 EUR |
iFluor™ 820 succinimidyl ester |
|||
| 1399 | AAT Bioquest | 1 mg | 367.2 EUR |
iFluor™ 860 succinimidyl ester |
|||
| 1409 | AAT Bioquest | 1 mg | 367.2 EUR |
trFluor™ Tb succinimidyl ester |
|||
| 1443 | AAT Bioquest | 1 mg | 1620 EUR |
ReadiView™ biotin succinimidyl ester |
|||
| 3059 | AAT Bioquest | 5 mg | 158.4 EUR |
iFluor™ 610 succinimidyl ester |
|||
| 1038 | AAT Bioquest | 1 mg | 262.8 EUR |
iFluor™ 546 succinimidyl ester |
|||
| 1048 | AAT Bioquest | 1 mg | 262.8 EUR |
iFluor™ 568 succinimidyl ester |
|||
| 1049 | AAT Bioquest | 1 mg | 262.8 EUR |
zFluor™ 647 succinimidyl ester |
|||
| 1500 | AAT Bioquest | 1 mg | 315.6 EUR |
zFluor™ 633 succinimidyl ester |
|||
| 1510 | AAT Bioquest | 1 mg | 315.6 EUR |
biotin, succinimidyl ester (biotin se) |
|||
| 90050 | Biotium | 100MG | 150 EUR |
4-pentynoic acid succinimidyl ester |
|||
| ADC-L-084 | Creative Biolabs | unit | Ask for price |
iFluor® 460 succinimidyl ester |
|||
| 1022 | AAT Bioquest | 1 mg | 211 EUR |
iFluor® 670 succinimidyl ester |
|||
| 1033 | AAT Bioquest | 1 mg | 222 EUR |
iFluor® 570 succinimidyl ester |
|||
| 1034 | AAT Bioquest | 1 mg | 222 EUR |
iFluor® 560 succinimidyl ester |
|||
| 1040 | AAT Bioquest | 1 mg | 222 EUR |
iFluor® 440 succinimidyl ester |
|||
| 1041 | AAT Bioquest | 1 mg | 211 EUR |
iFluor® 690 succinimidyl ester |
|||
| 1042 | AAT Bioquest | 1 mg | 308 EUR |
iFluor® 720 succinimidyl ester |
|||
| 1046 | AAT Bioquest | 1 mg | 308 EUR |
iFluor® 740 succinimidyl ester |
|||
| 1047 | AAT Bioquest | 1 mg | 308 EUR |
iFluor® 597 succinimidyl ester |
|||
| 1050 | AAT Bioquest | 1 mg | 308 EUR |
iFluor® 770 succinimidyl ester |
|||
| 1369 | AAT Bioquest | 1 mg | 222 EUR |
iFluor® 780 succinimidyl ester |
|||
| 1371 | AAT Bioquest | 1 mg | 222 EUR |
iFluor® 830 succinimidyl ester |
|||
| 1384 | AAT Bioquest | 1 mg | 334 EUR |
iFluor® 840 succinimidyl ester |
|||
| 1403 | AAT Bioquest | 1 mg | 334 EUR |
zFluor™ 635 succinimidyl ester |
|||
| 1501 | AAT Bioquest | 1 mg | 255 EUR |
iFluor® 665 succinimidyl ester |
|||
| 1550 | AAT Bioquest | 100 ug | 99 EUR |
iFluor® 665 succinimidyl ester |
|||
| 1551 | AAT Bioquest | 1 mg | 203 EUR |
iFluor® 665 succinimidyl ester |
|||
| 1552 | AAT Bioquest | 5 mg | 781 EUR |
iFluor® 665 succinimidyl ester |
|||
| 1553 | AAT Bioquest | 10 mg | 1301 EUR |
AzoDye-1 PEG10 Succinimidyl Ester |
|||
| 2403 | AAT Bioquest | 5 mg | 97 EUR |
iFluor® 350 succinimidyl ester |
|||
| 71020 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 405 succinimidyl ester |
|||
| 71021 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 460 succinimidyl ester |
|||
| 71022 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 488 succinimidyl ester |
|||
| 71023 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 514 succinimidyl ester |
|||
| 71024 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 532 succinimidyl ester |
|||
| 71025 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 450 succinimidyl ester |
|||
| 71026 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 555 succinimidyl ester |
|||
| 71028 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 594 succinimidyl ester |
|||
| 71029 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 633 succinimidyl ester |
|||
| 71030 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 647 succinimidyl ester |
|||
| 71031 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
iFluor® 660 succinimidyl ester |
|||
| 71032 | AAT Bioquest | 100 ug | 82 EUR |
Proponuje się, że hydroliza monowarstwy opartej na DSP przebiega zgodnie z mechanizmem reakcji z początkowym etapem zarodkowania, w przeciwieństwie do prostego prawa szybkości reakcji pseudopierwszego rzędu dla całej reakcji, wskazującego na silną zależność reakcji międzyfazowej od upakowania i obecność defektów w warstwie adlayer. Ta interpretacja jest wykorzystywana w późniejszej analizie wykresów kinetycznych IR-ERS, które dają stałą szybkości niejednorodnej aminolizy, ka, czyli ponad 3 rzędy wielkości niższą od stałej szybkości niejednorodnej hydrolizy, kh. Co ważniejsze, projekcja tych heterogenicznych szybkości kinetycznych na unieruchomienie białka sugeruje, że w warunkach sprzęgania, w których stosuje się niskie stężenia białka i bufory o pH zbliżonym do fizjologicznego, białka są bardziej prawdopodobnie fizycznie zaadsorbowane niż połączone kowalencyjnie.
Dodaj komentarz